揭秘疟原虫肝期清除机制：非经典自噬 “挑大梁”，一氧化氮 “退居幕后”

为探究 IFN-γ 介导清除疟原虫肝期（LS）机制，研究发现其由非经典自噬驱动，而非 NO，意义重大。

　　疟疾是一种严重危害人类健康的全球性寄生虫病，由蚊子传播的疟原虫感染引发。疟原虫在进入人体后，会先侵入肝细胞并发育为肝期（LS）。这一阶段虽然无症状，但却是疟原虫在人体内的第一个复制阶段，是其生命周期中的关键环节。如果能有效清除肝期疟原虫，就有望预防疟疾的发作以及阻止疟原虫传播给新的宿主。

目前，人们已知干扰素 γ（IFN-γ）在清除肝期疟原虫的过程中发挥着重要作用，但对于 IFN-γ 信号传导下游，肝细胞内清除肝期疟原虫的具体机制却知之甚少。以往的研究认为，IFN-γ 诱导肝细胞产生的一氧化氮（NO）在清除肝期疟原虫中起着关键作用。然而，这些研究大多是基于一些存在局限性的小分子抑制剂实验，其结果可能受到这些抑制剂脱靶效应的影响，使得这一结论的准确性受到质疑。

为了解开这一谜团，来自西雅图儿童研究所以及华盛顿大学等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《iScience》杂志上，为我们揭示了 IFN-γ 介导清除肝期疟原虫的新机制，对深入理解疟疾的免疫防御机制具有重要意义。

在研究中，研究人员采用了多种关键技术方法。他们利用小鼠模型，包括先天免疫和适应性免疫模型，以及体外肝细胞感染模型，来模拟疟原虫感染过程。通过基因敲除技术，构建了一氧化氮合酶 2（NOS2）基因敲除小鼠，以研究 NO 在清除肝期疟原虫中的作用。同时，运用 RNA 干扰（RNAi）技术，特异性地敲低相关基因的表达，探究不同基因在这一过程中的功能。此外，还借助显微镜和免疫荧光标记技术，对感染细胞进行观察和分析，以量化疟原虫的感染率和大小等指标。

研究结果如下：

1. 诱导型一氧化氮合酶对 IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除并非必需：研究人员通过体内实验发现，在先天免疫和适应性免疫的小鼠模型中，虽然保护性的 T 细胞反应依赖于 IFN-γ 来清除肝期疟原虫，但 NOS2 基因敲除小鼠仍然能够维持对二次肝期感染的抑制作用，这表明 NO 的产生并非是必需的。体外实验也进一步证实了这一点，在使用非选择性 NO 合酶抑制剂处理细胞后，IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除并未受到影响。而且，肝细胞在受到 IFN-γ 或多种细胞因子刺激时，并不会产生大量的 NO，这也解释了为何难以确定 NO 在清除肝期疟原虫中的作用。
2. 非经典自噬驱动 IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除：研究人员发现，在多种可能介导 IFN-γ 信号下游肝期疟原虫清除的途径中，抑制自噬会阻断 IFN-γ 对肝期疟原虫的清除作用，而抑制细胞凋亡和坏死性凋亡则没有这种影响。通过 RNAi 技术敲低参与自噬过程的相关基因，发现非经典自噬途径中的关键蛋白，如 Rubicon，以及在经典和非经典自噬中都起作用的 Beclin-1、ATG5 和 ATG7 等，对于 IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除和生长限制至关重要，这表明非经典自噬在这一过程中发挥着关键作用。
3. ATG16L1 对 IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除至关重要：ATG16L1 在非经典自噬过程中参与招募 ATG8 复合物。研究发现，虽然 IFN-γ 处理不会影响 ATG16L1 在肝期疟原虫寄生泡膜（PVM）上的定位，但敲低 ATG16L1 会逆转 IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除和生长限制，说明 ATG16L1 在这一过程中具有重要作用。
4. NOX2 参与 IFN-γ 诱导的肝期疟原虫清除：研究表明，Rubicon 能够稳定 NADPH 氧化酶 2（NOX2/gp91phox）在吞噬体膜上的定位，而 NOX2 产生的活性氧（ROS）可以限制病原体的生长。敲低 NOX2 会阻止 IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除和生长限制，并且在 IFN-γ 处理后，NOX2 会早期招募到 PVM 上。体内实验也证实，NOX2 基因敲除小鼠对二次肝期感染的清除能力明显下降，表明 NOX2 在肝期疟原虫清除中发挥着重要作用。
5. IFN-γ 诱导的肝期疟原虫清除需要 GABARAP：在 ATG8 家族蛋白中，研究发现 GABARAP、GABARAPL1 和 GABARAPL2 在 IFN-γ 介导的肝期疟原虫限制中起着关键作用。敲低这些蛋白会完全阻断 IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除和生长限制。IFN-γ 处理后，GABARAP 会大量定位到 PVM 上，且 GABARAP 标记的 PVM 与寄生虫生长限制相关。此外，敲低 LC3B 会增加 GABARAP 在 PVM 上的定位，提示 LC3B 可能对肝期疟原虫起到保护作用，阻碍 GABARAP 介导的清除。
6. IFN-γ 诱导的肝期疟原虫清除需要溶酶体融合：ATG8 与膜的结合为溶酶体融合提供信号，研究发现 IFN-γ 处理会增加 PVM 与溶酶体的接近程度。敲低调节溶酶体融合和成熟的小 GTPase RAB7A，会完全阻断 IFN-γ 介导的肝期疟原虫清除和生长限制，表明溶酶体与 PVM 的融合对于肝期疟原虫的清除是必需的。

研究结论和讨论部分指出，IFN-γ 信号对于清除早期和中期发育阶段的肝期疟原虫至关重要，但晚期肝期疟原虫对 IFN-γ 信号介导的清除具有抗性。研究明确了非经典自噬相关因子在这一过程中的重要性，尤其是 ATG8 家族中的 GABARAP 蛋白起着关键作用。同时，研究还表明肝期疟原虫的清除是通过溶酶体降解和 NOX2 产生的 ROS 共同作用实现的。这一研究成果纠正了以往对 NO 在清除肝期疟原虫中作用的错误认识，为深入理解宿主对疟疾感染的免疫防御机制提供了新的视角，也为开发针对疟疾的新治疗策略和疫苗提供了重要的理论依据。然而，该研究也存在一定的局限性，如自噬相关研究仅在体外进行，且使用的是鼠疟模型，未来还需要进一步研究来确定这些发现是否适用于人类疟疾寄生虫肝感染。