基于 G4 的比色荧光双模式检测无细胞线粒体 DNA 拷贝数研究成果

《Analytical Biochemistry》：Colorimetric and fluorescent dual-modality assay for cell-free mitochondrial DNA copy number in saliva

来自中国的研究人员开发比色荧光双模式检测 cf-mtDNA 拷贝数，检测限低且成本低。

　　线粒体通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP），支持细胞活动并维持细胞生命。它在细胞信号转导、钙稳态和细胞凋亡调节中也起着关键作用。线粒体功能障碍与多种人类疾病的发生和发展密切相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病，心血管疾病，癌症，代谢综合征以及其他线粒体疾病。因此，与线粒体相关的生物标志物，如线粒体 DNA，已成为诊断和监测这些疾病的重要指标。当细胞受损、凋亡或坏死时，线粒体 DNA 会释放到周围环境或血液中，形成无细胞线粒体 DNA（cf-mtDNA）。值得注意的是，cf-mtDNA 拷贝数的变化与多种疾病的病理状态和细胞适应性反应相关。定量实时聚合酶链反应（qPCR）和数字滴液聚合酶链反应（ddPCR）是最广泛用于定量测定 cf-mtDNA 拷贝数的方法。然而，qPCR 和 ddPCR 需要昂贵的设备和较高的实验条件，并且这些检测通常使用血液样本，采集不便。

G4 结构由鸟嘌呤（G）碱基的串联重复序列形成，通过特殊的氢键相互作用。与氯化血红素（Hemin）结合时，G4 结构表现出类似过氧化物酶的活性。它还可以与等温扩增等核酸扩增策略相结合，实现检测信号的指数级增加，因此在构建利用电化学和比色法等信号转导机制的高性能生物传感器方面具有重要价值。此外，硫黄素 T（ThT）对 G4 结构具有高亲和力和特异性，ThT 与 G4 的相互作用会导致荧光强度显著增强，使其成为实时监测应用生物传感器的常用成分。与血液样本相比，唾液可以无痛、无创地采集，极大地提高了受试者的舒适度和采样便利性。唾液中的生物标志物稳定、易于获取且保存简单，使唾液成为更安全、更简便、更高效的生物样本来源，特别适合大规模人群筛查和长期随访监测。

在本研究中，开发了一种基于 G4 的比色和荧光双模式检测方法，用于定量检测唾液中的 cf-mtDNA 拷贝数。研究人员设计了针对线粒体基因组细胞色素氧化酶基因（COX1）的聚合酶链反应（PCR）引物，并选择 G4 序列对引物进行修饰，以获得用于定量分析的视觉和荧光信号。系统优化了包括 Hemin、氯化钾（KCl）、2,2'- 联氮 - 二 (3 - 乙基 - 苯并噻唑 - 6 - 磺酸)（ABTS）、ThT 以及 ThT 孵育时间等检测条件。在优化条件下，评估了该传感器的灵敏度和特异性，包括其在人工唾液中的性能。

本研究开发的比色和荧光双模式检测方法，检测结果既可以通过肉眼定性识别，也可以通过分光光度法、RGB 视觉法和荧光法进行定量分析，应用场景更加多样化。其分光光度法、RGB 视觉法和荧光法的检测限分别低至 1.45×10^?1拷贝 /μL、1.65 拷贝 /μL 和 1.58×10^?1拷贝 /μL。与先前研究开发的 qPCR 和 ddPCR 方法相比，本研究的双模式检测方法检测限更低，且不依赖昂贵的 qPCR 和 ddPCR 设备，检测成本较低。因此，这种比色和荧光双模式检测方法是一种无标记且灵敏的评估 cf-mtDNA 水平的方法，为生物医学研究和临床诊断提供了有前景的应用。