高分辨率解析非转化细胞中细胞周期相关蛋白及磷酸化丰度变化，为细胞周期研究提供关键参考

为解决细胞周期研究难题，研究人员分析 hTERT-RPE-1 细胞周期，揭示蛋白和磷酸化变化，意义重大。

　　

细胞周期研究：探索生命进程的关键拼图

在微观的细胞世界里，细胞周期就像一场精密的交响乐，它掌控着一系列分子事件，这些事件受到蛋白质和磷酸化丰度协调变化的调控，最终促使一个细胞分裂为两个子细胞。这一过程的精准调控对于生命的正常运转至关重要，一旦出现差错，就可能引发如癌症等严重疾病。

然而，当前的细胞周期研究存在诸多挑战。以往的研究多基于癌细胞系，无法准确反映正常细胞周期的过程。而且，现有研究在细胞周期阶段的收集上存在局限，对磷酸化事件的检测和研究也不够深入，不同研究的数据分散，难以整合。为了填补这些知识空白，来自英国癌症研究所（The Institute of Cancer Research, London）的研究人员展开了一项重要研究，其成果发表在《Nature Communications》上。

研究方法：解锁细胞周期奥秘的钥匙

研究人员主要采用了以下关键技术方法：

• 细胞同步化技术：利用 CDK4/6 靶向抑制剂 palbociclib 使细胞在 G₁晚期的自然限制点停滞，实现细胞同步化，获取不同细胞周期阶段的细胞。同时，使用 Eg5 抑制剂 Dimethylenastron（DMA）诱导细胞在 prometaphase 停滞并释放进入 G₁期，进一步研究有丝分裂退出阶段的变化。
• 质谱分析技术：结合等压肽标记（TMT）定量质谱，对细胞周期不同阶段的蛋白质和磷酸化动态进行深度分析。通过该技术，研究人员能够量化蛋白质和磷酸化事件，从而揭示细胞周期相关的变化。
• 生物信息学分析：运用曲线拟合模型和 ANOVA 统计分析等方法，定义蛋白质和磷酸化的振荡模式，并对数据进行深入挖掘和分析。同时，通过与其他数据集整合，全面解析细胞周期调控机制。

研究结果：细胞周期的微观密码

1. 高分辨率时间进程蛋白质组和磷酸蛋白质组分析：研究人员在非转化的 hTERT - 永生化人视网膜色素上皮（RPE-1）细胞中，捕获了细胞分裂过程中的蛋白质和磷酸化动态。他们收集了八个对应不同细胞周期阶段的时间点样本，进行质谱分析，共量化了 8352 种蛋白质和 15424 个磷酸化事件。与以往研究相比，该数据集不仅识别出更广泛的细胞周期调节因子，还提供了更高的时间分辨率，能够更准确地呈现蛋白质振荡动态。
2. 定义细胞周期中的蛋白质和磷酸化振荡：通过曲线拟合模型和 ANOVA 统计分析，研究人员发现 3.7% 的蛋白质（306/8352）和 17% 的磷酸化事件（2268/13299）在细胞周期中变化大于 20%。在振荡的蛋白质中，包括多种周期蛋白（如 CCND1、CCND3、CCNE2 等）和其他知名的细胞周期调节因子；振荡的磷酸化事件中，包含许多已被充分研究的细胞周期调节磷酸化位点，如 CDK1 的 Thr161 和 Tyr15 磷酸化位点。此外，该研究还揭示了 211 种之前未被表征的在细胞周期进程中丰度发生变化的蛋白质。
3. 有丝分裂退出期间的蛋白质和磷酸化变化：为了更好地研究有丝分裂退出阶段的变化，研究人员使用 DMA 进行 prometaphase 停滞和释放实验。结果发现，在有丝分裂退出过程中，许多蛋白质和磷酸化位点发生了显著变化。例如，周期蛋白 CCNB1 在 prometaphase 停滞期显著富集，而在早期 G₁期则明显减少，这与它在中期降解以促进有丝分裂退出的功能一致。此外，研究还鉴定出 169 种蛋白质和 5046 个磷酸化位点在 prometaphase 和早期 G₁期之间差异表达。
4. 比较时间进程和有丝分裂退出数据集：研究人员将时间进程数据集和有丝分裂退出数据集进行整合，定义了一个单一的细胞周期依赖性（CCD）数据集。通过对振荡蛋白质的聚类分析发现，不同蛋白质在细胞周期的不同阶段积累，且蛋白质丰度的变化与有丝分裂退出数据集存在显著重叠。这表明两个数据集相互补充，共同为研究细胞周期调控提供了更全面的视角。
5. 细胞周期依赖性蛋白质的生物学作用：研究人员进一步对 CCD 蛋白质集进行功能表征，发现 CCD 蛋白质在细胞周期相关的注释、细胞结构和信号通路中高度富集。通过对不同蛋白质类别（如蛋白激酶、泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）成分和转录因子）的振荡分析，发现只有部分调节蛋白在细胞周期中表现出振荡模式。此外，研究还发现振荡蛋白质与转录水平的调控密切相关，且其降解对振荡行为有重要影响。同时，CCD 蛋白质与基因必需性存在显著关联，一些 CCD 蛋白质对细胞生存至关重要，而另一些则对细胞增殖无明显影响。
6. 驱动细胞周期进展的磷酸化动力学：在研究中，研究人员共鉴定出 22305 个磷酸化事件，其中 6528 个磷酸化位点表现出 CCD 行为。这些磷酸化事件主要发生在丝氨酸（78.6%）和苏氨酸（21.2%）上，且大多数位于蛋白质的无序和可及区域。CCD 磷酸化位点在不同物种中具有较高的保守性，且其振荡模式与预测的激酶活性相关。此外，磷酸化动力学可分为蛋白质依赖性和蛋白质非依赖性，分别反映了不同的调控机制。研究还发现，许多 CCD 磷酸化位点位于蛋白质相互作用界面或与已知基序重叠，可能在细胞周期调控中发挥重要作用。
7. CCD 蛋白质的降解机制：研究人员对 CCD 蛋白质的降解机制进行了深入研究，发现只有少数 CCD 蛋白质（55/401）含有已验证的降解基序，其中大部分是 APC/C 识别基序。通过对含有预测降解基序的蛋白质进行验证，证实了一些蛋白质（如 SGO2、GTSE1、MELK 等）是有丝分裂退出过程中 APC/C 的底物。然而，大多数 CCD 蛋白质的降解机制仍不清楚，这为后续研究提出了新的挑战。
8. 数据库：研究人员创建了细胞周期数据库（CCdb，https://slim.icr.ac.uk/cell_cycle/），该数据库包含了时间进程、有丝分裂退出和血清饥饿数据集的蛋白质和磷酸化位点的细胞周期丰度变化、统计指标以及细胞周期依赖性状态等信息。同时，数据库还整合了外部蛋白质、磷酸化位点、mRNA 丰度和细胞周期依赖性等信息，为细胞周期研究社区提供了一个宝贵的资源。

研究结论与讨论：开启细胞周期研究的新篇章

这项研究对非转化细胞中人类细胞周期的蛋白质和磷酸化变化进行了详细分析，具有重要意义。研究人员利用高分辨率定量质谱技术，对 401 种细胞周期振荡蛋白质进行了表征，其中包括 190 种已知蛋白质和 211 种新发现的在细胞周期中振荡的蛋白质，为该领域的研究提供了有价值的资源。

通过开发 CCdb 数据库，研究人员为细胞周期研究社区提供了一个用户友好的网络资源，方便研究人员对数据集进行交互式探索。该数据库不仅整合了多种数据信息，还将 CCD 丰度动态与功能变化联系起来，有助于深入理解细胞周期调控的复杂性。

然而，研究也存在一些局限性。例如，palbociclib 同步化可能会影响细胞周期的时间和蛋白质、磷酸化谱；虽然研究揭示了许多新的细胞周期相关蛋白质和磷酸化事件，但仍有大量的磷酸化事件功能未被表征，蛋白质降解机制也有待进一步探索。

尽管如此，该研究为细胞周期研究开辟了新的道路。它为深入理解细胞周期调控机制提供了更全面的视角，有助于推动相关领域的发展，为癌症等疾病的研究和治疗提供理论基础。相信在未来，随着研究的不断深入，我们将更加了解细胞周期的奥秘，为生命科学和健康医学领域带来更多突破。