果蝇 P75 的 PWWP 结构域识别富含胸腺嘧啶 DNA 的结构基础研究取得新突破

为探究果蝇 P75（dP75）结合染色质机制，研究人员解析其 PWWP 结构域，发现其偏好结合富含胸腺嘧啶 DNA，意义重大。

　　在生命的微观世界里，基因的表达调控就像一场精密的交响乐，每一个音符都至关重要。其中，染色质结合蛋白在这场 “交响乐” 中扮演着关键角色，它们决定着基因何时、何地以及如何演奏。果蝇 P75（dP75）作为人类 LEDGF/p75 的同源物，在卵子发生过程中起着不可或缺的作用，它就像一个勤劳的 “指挥助手”，通过招募组蛋白激酶 Jil-1 到常染色质区域，并阻止 H3K9me₂的扩散，保障着基因表达的和谐有序。然而，尽管 dP75 与转录活跃的染色质紧密结合，但其具体的作用机制却一直如同迷雾，困扰着科学家们。

为了揭开这层神秘的面纱，来自上海交通大学新华医院、上海科技大学等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们深入研究 dP75 的 PWWP 结构域（属于经典组蛋白阅读器 “Royal” 家族，对染色质结合至关重要），试图找到理解其功能的关键钥匙。研究成果发表在《Communications Biology》上，为我们理解染色质结合机制带来了新的曙光。

研究人员运用了多种关键技术方法来开展这项研究。其中，晶体学技术帮助他们解析了 dP75 PWWP 结构域在游离状态和与单链 DNA（ssDNA）结合状态下的晶体结构，如同为这个微观结构拍摄了高清照片。体外结合实验，如荧光偏振（FP）实验，精确测定了 dP75 PWWP 结构域与不同 DNA 序列的结合亲和力，量化了它们之间的相互作用。体内功能实验则利用转基因果蝇模型，通过点突变技术改变关键氨基酸残基，深入探究这些突变对 dP75 功能的影响，从而在活体环境中验证了理论推测。

下面来看看具体的研究结果：

1. dP75 PWWP 的晶体结构：dP75 PWWP 结构域形成了独特的马鞍形结构域交换同源二聚体。与 LEDGF 的 PWWP 结构域相比，它缺少两个 AT 钩，但拥有一些独特的结构特征，如连接 α1 和 α2 的区域形成了螺旋构象，而非其他 PWWP 结构中的环。这种独特的结构为其功能奠定了基础。
2. dP75 PWWP 在溶液和体内的二聚体状态：通过尺寸排阻色谱（SEC）、交联质谱、基于大肠杆菌转录机制的二聚体报告系统以及 split-luciferase 实验等多种方法，研究人员证实了 dP75 PWWP 在溶液和体内均以结构域交换二聚体的形式存在。这表明二聚体的形成并非晶体包装的假象，而是其在生理环境中的真实存在形式。
3. dP75 PWWP 对含胸腺嘧啶 DNA 的结合偏好：FP 实验表明，dP75 PWWP 结构域对富含胸腺嘧啶的 DNA 序列具有强烈的结合偏好，无论是双链 DNA 还是单链 DNA。它与 12 bp 的 poly (A:T) 双链 DNA 和富含胸腺嘧啶的单链 DNA（如 FAM-polyT）都有较高的结合亲和力，而对其他碱基组成的 DNA 序列结合较弱或几乎不结合。这一特性与 LEDGF 的 PWWP 结构域形成鲜明对比，凸显了 dP75 PWWP 的独特性。
4. dP75 PWWP 与单链 DNA 结合的整体结构：dP75 PWWP 与 5 -mer ssDNA（5'-TCCCT-3'）的共晶体结构显示，两个带正电的凹槽沿着 “马鞍状” 结构表面分布，有利于 DNA 结合。胸腺嘧啶核苷酸嵌入传统上用于结合组蛋白修饰中三甲基赖氨酸的芳香口袋，这种结合模式在 LEDGF 的 PWWP 结构域中并未发现。
5. dP75 PWWP 对胸腺嘧啶核苷酸的识别机制：dP75 PWWP 与胸腺嘧啶的相互作用主要包括氢键和 π-π 堆积。Y23、F43 等关键氨基酸残基参与了对胸腺嘧啶的识别，突变这些残基会显著影响其与 DNA 的结合能力。此外，K21、K38 和 K53 等赖氨酸残基与 DNA 主链的静电相互作用也对结合起到重要作用。
6. PWWP 结构域关键残基对 dP75 功能的重要性：通过构建转基因果蝇，研究人员发现 PWWP 结构域中 Y23、W26、F43、E48 等关键残基的点突变会导致 dP75 的染色质结合能力显著下降，无法恢复 dP75 敲除果蝇的不育表型，也不能抑制 H3K9me₂的扩散和转座子的激活。这表明这些关键残基对于 dP75 的功能至关重要。
7. PWWP 结构域在缺乏 H3K36me₃时对 dP75 染色质结合的重要性：利用 H3K36A 果蝇突变体，研究人员发现 dP75 在缺乏 H3K36me₃的情况下仍能结合染色质，尽管部分样本中信号强度有所减弱。然而，引入 Y23A 和 E48A 突变后，dP75 在 H3K36A 突变体中的染色质定位明显减少，这进一步证实了芳香口袋在 dP75 DNA 结合中的重要作用。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 dP75 PWWP 结构域独特的二聚体结构和对富含胸腺嘧啶 DNA 的偏好性结合机制。突变关键残基对 dP75 功能的影响表明，这些残基在维持染色质稳定性、抑制转座子激活以及保障雌性生育能力等方面起着不可或缺的作用。此外，研究还发现 dP75 在缺乏 H3K36me₃的情况下仍能有效结合染色质，这为理解 dP75 的染色质结合机制提供了新的视角。同时，dP75 与组蛋白激酶 Jil-1 的潜在相互作用也为进一步研究其在染色质动力学中的功能提供了方向。

总的来说，这项研究不仅揭示了 dP75 PWWP 结构域的双重功能 —— 作为组蛋白和碱基阅读器，还为深入理解染色质生物学提供了重要线索，为后续研究 dP75 在基因表达调控中的作用奠定了坚实基础，有望推动相关领域的进一步发展。