工程改造新型溶瘤单纯疱疹病毒 - 1 用于癌症治疗：潜力与进展

本文介绍了新型 HSV-1 毒株 UT1a 的改造，OncoDelta（OncoD）安全有效，为癌症治疗带来新希望。

　　

一、引言

溶瘤病毒作为新兴的生物疗法，通过直接破坏肿瘤细胞并释放肿瘤抗原启动抗肿瘤免疫。目前有多种病毒用于相关研究，其中基于单纯疱疹病毒 - 1（HSV-1）的两种溶瘤疗法已获批。Imlygic 在美国和欧洲获批用于治疗晚期黑色素瘤，DELYTACT 在日本获批用于治疗复发性胶质母细胞瘤（GBM）。Imlygic 删除了 RL1 基因的两个拷贝并额外缺失 ICP47 基因，保留了 UL39 和 UL40 基因，还携带粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）增强抗肿瘤免疫反应；DELYTACT 是一种未携带额外基因的三重突变溶瘤病毒，破坏了 UL39 基因，删除了 ICP34.5 和 ICP47 基因。利用这些病毒作为基因治疗载体以改善肿瘤细胞杀伤和增强抗肿瘤免疫反应是重要研究方向，而具有易于插入治疗性有效载荷的病毒骨架也至关重要。

在此背景下，研究人员从去识别化且获得同意的患者生物样本库中分离出一种新的 HSV-1 毒株 UT1a，并对其进行工程改造以制备溶瘤 HSV（oHSV）。UT1a 在杀伤肿瘤细胞方面表现优于 F 毒株 HSV-1。通过删除病毒神经毒力基因，生成了 OncoDelta（OncoD），这是一种三重基因缺失的 oHSV-1 病毒，在无肿瘤小鼠中安全性良好，对多种肿瘤模型有效，且对抗病毒药物敏感。OncoD 的病毒骨架删除了 ICP34.5 的两个拷贝以及 UL39 和 UL40 基因，但保留了野生型 ICP47 基因。

二、研究结果

1. 病毒株的分离与改造：UT1a 毒株源自休斯顿德克萨斯大学健康科学中心经机构审查委员会（IRB）批准协议下的一位患者唇部病变。分离后在 Vero 细胞中培养。对比 WT HSV-1 的 UT1a 和 F 毒株对一系列肿瘤细胞的细胞毒性，发现 UT1a 对肿瘤细胞的毒性更强。利用 CRISPR-Cas9 引导的同源重组（HR）技术，将翻转酶识别靶位点（FRT）和 loxP 侧翼的细菌人工染色体（BAC）基因插入到 UL39/UL40 位点，通过 DNA 测序确认 BAC 序列插入和 UL39/UL40 缺失。之后，利用 HR 技术在细菌中靶向 γ34.5 表达基因（RL1），经 PCR 验证 RL1 缺失。
2. OncoD 的特性研究：设计插入 UL39/UL40 位点的含 GFP 的 BAC 序列两侧为 FRT 和 loxP 重组位点。通过 FRT - 基于的重组，将含 RFP 的转移质粒插入 BAC，再经 loxP 位点间的重组去除细菌序列，从而方便在溶瘤病毒骨架中插入转基因。验证 OncoD 中 ICP34.5 缺失的方法包括病毒基因组 PCR 和对磷酸化真核起始因子 2α（p - eIF2α）的 western blot 检测，因为野生型病毒中的 ICP34.5 可使 eIF2α 去磷酸化，而 ICP34.5 缺失的病毒会导致 eIF2α 磷酸化增加。实时成像显示 OncoD 在肿瘤细胞中高效复制，但在正常细胞中不复制。与之前发表的双缺失（ΔRL1 和 ΔUL39）的 oHSVQ 相比，OncoD 虽然有三重缺失，但病毒复制（爆发大小）更高，病毒产量也更高，且两者在体外对肿瘤细胞的细胞毒性相似，在正常细胞中均无细胞毒性。
3. OncoD 的敏感性和安全性评估：评估 OncoD 对阿昔洛韦（ACV）的敏感性，结果显示 ACV 对 OncoD 介导的细胞毒性有 95.3% ± 6.3% 的保护作用，与 oHSVQ 相似。由于 OncoD 病毒复制增加，病毒滴度更高，可在体内评估更高剂量。在小鼠安全性实验中，颅内接种 5×102 噬斑形成单位（PFUs）的 UT1a 病毒对 4/5 的非肿瘤成年小鼠有毒性，而 OncoD 在高达 5×10? PFUs（最大注射剂量）时对正常小鼠安全且耐受性良好，oHSVQ 的最大注射剂量为 1×10? PFUs。
4. OncoD 的体内疗效研究：在多种小鼠肿瘤模型中评估 OncoD 的体内疗效，包括 NSG 小鼠的人肿瘤（GBM12）和免疫健全小鼠的同基因小鼠肿瘤（A20、LLC 和 MC38），结果表明 OncoD 治疗有效。对人胶质瘤细胞（GBM12 和 GBM28）进行转录组分析，发现与未处理细胞相比，经 OncoD 处理的细胞中凋亡和 DNA 修复相关通路显著富集。OncoD 感染诱导 γH2AX 蛋白水平升高，提示细胞 DNA 损伤增加。联合 OncoD 和放疗（IR）的实验显示，无论是体外的克隆形成实验（包括球体形成和有限稀释分析），还是体内免疫健全小鼠的实验，联合治疗均显著降低细胞克隆形成能力，提高小鼠生存率，表明 OncoD 与放疗具有协同作用。

三、讨论

研究人员成功改造出一种三重基因缺失的 HSV-1 来源的溶瘤病毒 OncoD。UL39 和 UL40 编码核糖核苷酸还原酶（RR）的大亚基和小亚基，在静止细胞中启动核苷酸代谢至关重要。哺乳动物细胞中该过程受 Rb 通路调控，肿瘤细胞中 Rb 通路异常，使得细胞 RR 可补偿病毒 RR 缺失，从而赋予 OncoD 肿瘤特异性。OncoD 是目前唯一同时缺失 RR 两个亚基的溶瘤病毒。RL1 基因编码的多功能 ICP34.5 可帮助 HSV-1 对抗多种抗病毒防御反应，还参与 HSV-1 潜伏感染的再激活。细胞中的 EIF2AK2 可感知感染并磷酸化 eIF2α 以阻断蛋白质翻译和病毒复制，而 ICP34.5 可逆转这一过程。OncoD 中缺乏功能性 ICP34.5，经 PCR 和 western blot 分析验证。尽管 OncoD 有三重突变，而 HSVQ 只有两重缺失，但 OncoD 的病毒爆发更大，病毒产量更高。

除了具有更好的病毒产量和肿瘤细胞特异性细胞毒性外，OncoD 对 ACV 敏感，在小鼠脑内注射安全。在多种肿瘤模型中，OncoD 单独或联合放疗均显示出更好的治疗效果。基于 OncoD 在多个方面的良好表现，建议进一步将其开发为抗肿瘤药物。

四、材料和方法

更多方法细节在补充信息中。动物研究经奥古斯塔大学机构动物护理和使用委员会批准。使用的小鼠品系包括 NSG、C57BL/6 和 BALB/c，购自杰克逊实验室。颅内注射方法已描述。建立皮下肿瘤模型时，不同肿瘤细胞系注射数量和体积不同，待肿瘤达到一定体积后分组，分别给予 OncoD 或 PBS 处理，并定期测量肿瘤体积，达到终点时处死小鼠。

五、数据和代码可用性

处理后的和原始的 RNA 测序数据可在基因表达综合数据库（登录号 GEO: GSE288846）获取。本文的源数据可向相应作者合理索取。

六、致谢

感谢佐治亚癌症中心综合基因组共享资源和生物技术与基因组医学中心的专家人员的帮助。该项目得到相关资助，内容仅代表作者观点，不一定代表美国基因与细胞治疗学会官方观点。

七、作者贡献

K.V.-A. 设计并进行实验、分析数据和撰写论文；A.G. 协助 UT-BAC 的基因组修饰；A.W. 和 X.M. 进行 UT-BAC 与 UT1a 和 F 毒株基因组的测序和比对；Y.O. 协助 UT1a 的表征和 UT1a 与 F 毒株细胞毒性比较；B.K. 提出研究思路、监督项目并协助撰写论文。所有作者阅读、编辑并批准了论文。

八、利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

九、补充信息

补充信息包含多个文件，如 mmc1.pdf（包含图 S1 - S3 和补充材料与方法）、mmc2.csv（GBM12 细胞感染 OncoD 相对于 PBS 的显著差异调节基因表）、mmc3.xlsx（GBM28 细胞感染 OncoD 相对于 PBS 的显著差异调节基因表）、mmc4.pdf（文章及补充信息）等，可下载获取详细内容。