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本文揭示巨噬细胞磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）可调控 MAFLD 进展，或为其治疗提供新策略。
巨噬细胞在代谢功能障碍相关脂肪性肝病中的关键作用
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）是一种复杂的代谢疾病，影响着全球约 25% 的成年人口。超过 20% 的 MAFLD 患者会从单纯性脂肪变性进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），MASH 常伴有肥胖、2 型糖尿病等代谢紊乱，若不加以控制，可能发展为肝硬化和肝癌。目前，MAFLD 的治疗手段有限，首个获批用于 MASH 治疗的药物 Rezdiffra（活性成分 resmetirom）是甲状腺激素受体 -β 激动剂，通过激活肝脏中的该受体来减少患者肝脏脂肪积累。
肝脏巨噬细胞约占肝脏细胞总数的 15%，由肝驻留巨噬细胞（Kupffer 细胞，KCs）和浸润巨噬细胞（主要是单核细胞来源的巨噬细胞，MDMs）组成，它们在肝脏免疫稳态和各种肝脏疾病（如 MAFLD）的发展中起着重要作用。在 MAFLD 进展过程中，巨噬细胞会检测到饱和脂肪酸（如棕榈酸，PA）等危险信号，激活 Toll 样受体（TLR）介导的信号通路，分泌白细胞介素（IL）-6、IL-1β 等促炎细胞因子，进而导致中性粒细胞募集、胰岛素抵抗（IR）和肝细胞代谢改变，促进脂肪生成、糖异生和细胞增殖，增加的脂毒性又会进一步刺激巨噬细胞激活。
丝氨酸代谢与 PHGDH 在 MAFLD 中的研究现状
丝氨酸是一种非必需氨基酸，在糖酵解、一碳代谢、脂质代谢以及嘌呤和谷胱甘肽合成中起着关键作用。细胞可以通过氨基酸转运体从周围环境获取丝氨酸，也可以通过丝氨酸合成途径从葡萄糖合成，而磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）是该途径的第一个关键酶。研究发现，MAFLD 患者肝细胞存在丝氨酸缺乏，下调肝脏 PHGDH 和降低丝氨酸水平会导致小鼠 MAFLD 的发生，抑制 PHGDH 会损害肝脏脂质稳态和积累，而外源性丝氨酸补充可抑制小鼠 MAFLD 的进展。
此外，越来越多的研究表明，PHGDH 在调节先天和适应性免疫方面发挥着重要作用，包括调节巨噬细胞中 IL-1β、IFN-β 的产生，T 效应细胞的增殖以及调节性 T 细胞的功能等。然而，巨噬细胞 PHGDH 在脂毒性诱导的炎症反应和 MAFLD 进展中的具体作用尚不清楚，有待进一步研究。
巨噬细胞 PHGDH 负向调节 PA 诱导的促炎细胞因子产生
为了探究巨噬细胞 PHGDH 是否参与脂毒性诱导的炎症反应和 MAFLD 的发病机制，研究人员首先检测了 PA 刺激后骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中 PHGDH 的表达。结果发现，PA 刺激显著增加了 PHGDH 的 mRNA 和蛋白质水平。进一步研究表明，用靶向 PHGDH 的小干扰 RNA（siPHGDH）敲低 PHGDH 后，PA 处理的 RAW264.7 细胞中促炎细胞因子 Il-6 和 Il-1β 的表达显著增加。
研究人员构建了髓系特异性 PHGDH 基因敲除小鼠（Phgdhfl/flLyz2-Cre+，简称 PHGDH-KO-M? 小鼠）及其对照小鼠（Phgdhfl/flLyz2-Cre?，简称 PHGDH-WT-M? 小鼠）。流式细胞术结果显示，PHGDH 敲除对脾脏中 T 细胞、NK 细胞、B 细胞和树突状细胞的分化和数量没有显著影响，但 PHGDH-KO-M? 小鼠的 KCs 和 BMDMs 中 PHGDH 蛋白表达显著降低，同时促炎细胞因子表达上调。相反，PHGDH 过表达则以剂量依赖的方式降低了这些促炎细胞因子的表达，即使在 PA 刺激使 PHGDH 蛋白水平升高的情况下也是如此。这些结果表明，PHGDH 抑制了 PA 诱导的促炎细胞因子的表达，在巨噬细胞介导的炎症中发挥抗炎作用。
髓系特异性 PHGDH 缺乏加剧 MAFLD 进展
为了明确巨噬细胞 PHGDH 在 MAFLD 体内发病机制中的作用，研究人员对 PHGDH-KO-M? 小鼠和 PHGDH-WT-M? 小鼠进行了饮食干预。分别给予它们高脂肪饮食（HFD）或对照饮食 24 周，以及高脂肪 / 高胆固醇饮食（HFHC）或对照饮食 16 周。结果发现，饮食干预后，PHGDH-KO-M? 小鼠和 PHGDH-WT-M? 小鼠的体重没有显著差异，但 PHGDH-KO-M? 小鼠的肝脏重量和肝脏重量与体重的比值显著增加，血糖水平和胰岛素抵抗也明显升高。
HFD 或 HFHC 喂养的 PHGDH-KO-M? 小鼠的附睾白色脂肪组织和肝脏中出现严重的脂质积累，同时肝脏中脂质合成相关基因的表达增加，总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）浓度升高。此外，RT-qPCR 分析显示，HFD 或 HFHC 喂养的 PHGDH-KO-M? 小鼠肝脏中促炎细胞因子和趋化因子的表达显著增加，HFHC 喂养的 PHGDH-KO-M? 小鼠肝纤维化更严重， profibrotic 基因表达水平更高，肝脏切片免疫荧光染色显示 IL-1β+巨噬细胞的比例显著增加，血清中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高，表明肝脏损伤更严重。这些结果表明，髓系特异性 PHGDH 基因缺失加剧了 MAFLD 的进展。
研究人员进一步通过共培养实验探究了 PHGDH 缺乏导致的巨噬细胞脂毒性炎症反应是否会促进肝细胞脂质积累。将 PA 刺激的 PHGDH-WT 或 PHGDH-KO 巨噬细胞与原代 PHGDH-WT 肝细胞共培养，发现 PA 刺激的 PHGDH-KO 巨噬细胞分泌的促炎细胞因子增加，与这些巨噬细胞共培养的肝细胞中脂质生成相关基因的表达增加，TG 含量和脂质积累也增加。使用中和抗体阻断 IL-6、IL-1β 或 TNF-α 后，与 PHGDH-KO 巨噬细胞共培养的肝细胞脂质积累显著减少，达到与 PHGDH-WT 巨噬细胞共培养时的水平。这表明 PHGDH 缺乏增强了巨噬细胞的脂毒性炎症反应，进而加剧了肝细胞的脂质积累。
PHGDH 抑制 PA 介导的 TAK1-NF-κB/MAPK 信号通路
为了探究 PHGDH 在 MAFLD 中的潜在调节机制，研究人员检测了 PA 处理对 TLR4 介导的炎症信号通路的影响。Western blot 分析显示，PA 刺激后，PHGDH-KO-M? BMDMs 中 TAK1、IκB 激酶（IKK）α/β、JNK 和 p38（但不包括 ERK）的激活增加，PHGDH 敲除增加了 p65 核转位和 NF-κB 靶基因（包括Ccl5、ler3、Lta和Bcl2）的表达。
由于 TAK1 是 NF-κB 和 JNK/p38 信号通路的关键上游调节因子，研究人员推测 PHGDH 可能通过调节 TAK1 来抑制巨噬细胞的炎症反应。用 TAK1 抑制剂 5Z-7-oxozeaenol（5Z-7-ox）处理后，逆转了 PHGDH 缺乏导致的 TAK1-NF-κB/MAPK 信号通路激活和炎症因子表达增加。这些结果表明，PHGDH 可以抑制 PA 介导的 TAK1-NF-κB/MAPK 信号通路，通过 TAK1 抑制巨噬细胞的炎症反应。
PHGDH 与 TAK1 相互作用
除了代谢功能外，代谢酶还可以通过介导蛋白质的翻译后修饰、作为转录因子或调节因子，或直接结合并影响相关功能蛋白来调节细胞信号，发挥非代谢功能。为了进一步探究 PHGDH 如何通过 TAK1 影响巨噬细胞介导的炎症信号通路，研究人员进行了免疫沉淀（IP）实验。结果发现，PHGDH 与 TAK1 相互作用，且这种相互作用在 PA 刺激 RAW264.7 细胞 30 分钟后受到抑制。时间进程分析和邻近连接实验表明，PA 处理后 15 - 60 分钟，PHGDH 与 TAK1 的相互作用显著降低。此外，TLR3 激动剂 poly (I:C) 也降低了 TAK1 的激活和 PHGDH 与 TAK1 的相互作用，表明 PHGDH 通过与 TAK1 相互作用调节 TAK1 活性的机制可能受到不同促炎刺激的广泛调节。
研究人员进一步探索了 PHGDH 与 TAK1 相互作用的关键结构域。PHGDH 蛋白包含两个底物结合结构域（氨基酸 9 - 111 和 112 - 285）、一个核苷酸结合结构域（氨基酸 286 - 317）和一个调节结构域（氨基酸 322 - 533），TAK1 蛋白在 N 端包含一个激酶结构域（氨基酸 43 - 284）和一个 TAB1 结合结构域（氨基酸 77 - 303），在 C 端包含一个 TAB2/TAB3 结合结构域（氨基酸 479 - 533）。IP 实验表明，HA 标记的野生型 PHGDH 和 HA-PHGDH（氨基酸 286 - 533）片段与 FLAG 标记的 TAK1 相互作用，FLAG 标记的野生型 TAK1 和 FLAG-TAK1（氨基酸 1 - 300）及（氨基酸 1 - 480）片段与 HA 标记的 PHGDH 相互作用，即 PHGDH 的氨基酸 286 - 533 结构域与 TAK1 的氨基酸 1 - 300 结构域相互作用。纯化的重组 PHGDH 和 PHGDH（氨基酸 286 - 533）可以与野生型 TAK1 相互作用，反之亦然。此外，过表达野生型 PHGDH 或 PHGDH（氨基酸 286 - 533）片段可以逆转 PA 介导的 TAK1-NF-κB/MAPK 信号通路激活和 PHGDH 缺乏导致的炎症因子表达升高。这些结果表明，PHGDH 的氨基酸 286 - 533 结构域在调节巨噬细胞的炎症反应中起着重要作用。
四聚体形式的 PHGDH 在调节巨噬细胞炎症反应中起关键作用
全长 PHGDH 在溶液中以单体、二聚体和四聚体的动态混合物形式存在。为了确定与 TAK1 结合的 PHGDH 的具体形式，研究人员利用 AlphaFold3 软件预测了两种蛋白质的三维结构，并使用 HDOCK 软件进行分子对接分析。结果显示，PHGDH 四聚体与 TAK1 的结合能为 - 233.37 kcal/mol，高于二聚体的 - 226.54 kcal/mol，且四聚体形成的氢键数量更多，相互作用残基分布更广泛，表明 PHGDH 四聚体与 TAK1 的相互作用稳定性更高。
Western blot 和 IP 实验表明，PHGDH 抑制剂 CBR-5884 可使 PHGDH 从四聚体转变为二聚体，减弱了 TAK1 与 PHGDH 的相互作用，增加了 PA 诱导的 TAK1 激活和促炎细胞因子表达。为了进一步探究 PHGDH 四聚体是否通过 TAK1 抑制巨噬细胞炎症，研究人员构建了 TAK1-T184/187A 和 TAK1-T184/187D 突变体，其中 T184 和 T187 分别被替换为丙氨酸或天冬氨酸。RT-qPCR 结果显示，敲低 TAK1 抑制了 CBR-5884 处理导致的炎症因子表达增加，过表达野生型 TAK1 或 TAK1-T184/187D 突变体（组成型激活）可逆转这种效应，而过表达 TAK1-T184/187A 突变体（不能磷酸化或激活）则不能逆转，表明 PHGDH 四聚体通过 TAK1 抑制巨噬细胞的炎症反应。
由于 PHGDH 四聚体是丝氨酸合成的功能形式，研究人员还探究了丝氨酸对 PA 诱导的炎症的影响。结果发现，缺乏丝氨酸和甘氨酸（-SG）与 PHGDH 敲除相似，显著增加了 PA 诱导的炎症因子表达，且缺乏 SG 与 PHGDH 敲除协同增强了巨噬细胞的炎症反应，表明 PHGDH 在丝氨酸合成中的酶活性在 PA 诱导的炎症中起作用。PHGDH 的活性位点 V425 突变为蛋氨酸（M）会显著降低其酶活性，与野生型 PHGDH 不同，PHGDH（V425M）突变体不能恢复 PHGDH 敲低后 PA 刺激诱导的 TAK1 激活和促炎细胞因子表达升高。
进一步研究发现，V425 位于与 TAK1 相互作用的氨基酸 286 - 533 结构域内，突变 V425 会降低 PHGDH 四聚体的结构评分参数，增加其与 TAK1 的结合能，减弱其与 TAK1 的结合亲和力，还会减少 PHGDH 的四聚化，增加其二聚化，抑制 PHGDH-TAK1 结合，并减弱与 PHGDH 分子伴侣 DNAJA1 的相互作用。这些结果表明，PHGDH V425 至少部分通过影响 PHGDH 的寡聚化状态及其与 TAK1 的相互作用来影响 PA 介导的炎症反应。
PHGDH 通过抑制 TAB1 与 TAK1 的相互作用调节 PA 诱导的炎症
为了进一步探究 PHGDH 与 TAK1 相互作用调节巨噬细胞炎症反应的具体机制，研究人员检测了 PHGDH 对 TAK1 泛素化和自磷酸化的影响。IP 实验结果显示，PHGDH 对总 TAK1 泛素化水平和 TRAF6 介导的 TAK1 泛素化水平没有显著影响，但抑制了 TAB1 与 TAK1 的相互作用，降低了 TAK1 的磷酸化水平。
此外，过表达全长 PHGDH 或 PHGDH（氨基酸 286 - 533）片段（与 TAK1 结合的结构域），但不是 PHGDH（氨基酸 1 - 285）片段或 PHGDH（V425M）突变体，抑制了 PA 刺激后 TAB1 介导的 TAK1-NF-κB/MAPK 信号通路激活和促炎细胞因子表达。这些结果表明，PHGDH 通过抑制 TAB1 与 TAK1 的相互作用来调节 PA 诱导的巨噬细胞炎症。
抑制 TAK1 可消除髓系特异性 PHGDH 缺乏促进的 MASH 进展
为了进一步探究 TAK1 在 PHGDH 介导的 MASH 发展中的作用，研究人员对 6 - 8 周龄的野生型和 PHGDH-KO-M? 雄性小鼠进行了实验。给小鼠腹腔注射 TAK1 抑制剂 5Z-7-ox（5 mg/kg，每 3 天一次，共 16 周）或溶剂，并喂养 HFHC 饮食 16 周。Western blot 分析显示，5Z-7-ox 有效抑制了 PHGDH 缺乏诱导的 TAK1-NF-κB/MAPK 信号通路激活。
实验结果表明，5Z-7-ox 降低了 PHGDH 缺乏导致的肝脏重量和肝脏重量与体重比值的增加，缓解了胰岛素抵抗，减轻了 HFHC 饮食喂养的 PHGDH-KO-M? 小鼠的脂质积累、炎症、纤维化和肝脏损伤。这些结果进一步证实了 PHGDH 通过抑制 TAK1 减轻 MASH 的进展。
AAV 介导的肝脏巨噬细胞 PHGDH 过表达减轻 HFHC 饮食诱导的 MASH 进展
最后，研究人员研究了肝脏巨噬细胞 PHGDH 在 MASH 中的治疗效果。利用重组 AAV8 递送系统在小鼠肝脏巨噬细胞中过表达Phgdh，将携带小鼠Phgdh的 AAV8 载体（AAV-Phgdh）或空载体（AAV-EGFP）通过尾静脉注射到喂养 HFHC 饮食 8 周的小鼠体内，然后继续喂养 HFHC 饮食 8 周。免疫荧光染色和 Western blot 结果证实了 AAV-Phgdh注射小鼠的肝脏巨噬细胞中 PHGDH 的过表达，且 EGFP 与其他肝细胞标记物（如肝窦内皮细胞标记物 SE-1、星状细胞标记物 α-SMA 和肝细胞标记物 AFP）没有共定位，表明 AAV8 病毒有效地靶向肝脏巨噬细胞。
与 AAV-EGFP 注射小鼠相比，AAV-Phgdh注射小鼠在 HFHC 饮食喂养 16 周后，肝脏重量和肝脏重量与体重比值显著降低，体重仅有轻微变化，同时胰岛素抵抗、脂质积累、炎症、纤维化和肝脏损伤也明显减轻。这些结果表明，AAV 介导的肝脏巨噬细胞 PHGDH 过表达可以减轻 HFHC 饮食诱导的 MASH 进展。
研究讨论与展望
巨噬细胞作为主要的炎症效应细胞，在 MAFLD 的进展中起着至关重要的作用。肝脏 PHGDH 已被证明在调节脂质代谢和 MAFLD 进展中具有重要作用，但巨噬细胞 PHGDH 在 MAFLD 中的作用尚不清楚。本研究表明，巨噬细胞 PHGDH 可以通过调节脂毒性诱导的炎症反应来减轻 MAFLD 的进展。具体而言，遗传抑制 PHGDH 会促进巨噬细胞中 PA 诱导的脂<毒性炎症反应，加剧饮食诱导的 mafl 和 mash，而过表达 phgdh 则可缓解 mash 的进展，这为 mash>
近期研究表明，PHGDH 对巨噬细胞介导的炎症反应的调节作用存在争议。一些研究发现，PHGDH 介导的丝氨酸合成通过 NAD?依赖的蛋白质乙酰化、促进谷胱甘肽合成或 S - 腺苷甲硫氨酸介导的组蛋白甲基化来维持 LPS 诱导的巨噬细胞中 IL-1β 的产生；而另一些研究则表明，PHGDH 缺乏会促进 IFN-γ 或 LPS 激活的巨噬细胞中促炎细胞因子 IL-1β 的表达。这种差异可能归因于不同的炎症刺激和 PHGDH 的非代谢功能。
本研究的机制表明，四聚体形式的 PHGDH 通过非代谢功能破坏 TAK1 与衔接蛋白 TAB1 的结合，从而降低 TAK1 的活性，抑制 PA 诱导的巨噬细胞炎症反应和 MAFLD 进展。这揭示了 PHGDH 作为 TAK1 的结合剂和调节剂的新功能，为 MAFLD 的临床治疗提供了新的思路。
然而，本研究也存在一定的局限性。研究主要集中在关键丝氨酸合成酶 PHGDH 在 MAFLD 中的非代谢调节功能，未来还需要进一步研究 PHGDH 在巨噬细胞中的代谢酶作用，以更全面地阐明丝氨酸代谢在 MAFLD 发展中的作用。此外，研究仅对 PHGDH 基因敲除和对照小鼠在 HFD 下进行了表型分析，未探索腺相关病毒介导的 PHGDH 过表达在减轻 HFD 诱导的 MAFL 方面的治疗潜力。
总体而言，本研究为理解巨噬细胞 PHGDH 在 MAFLD 中的作用提供了重要的见解，为开发新的 MAFLD 治疗策略奠定了基础。未来的研究可以进一步深入探究 PHGDH 的代谢和非代谢功能，以及其在不同炎症环境下的作用机制，有望为 MAFLD 的治疗带来新的突破。
