靶向灭活 EWSR1::FLI1基因：尤文肉瘤基因治疗新突破

为解决尤文肉瘤治疗难题，研究人员用 CRISPR/Cas9 靶向灭活 EWSR1::FLI1基因，成果有望用于治疗。

　　

尤文肉瘤治疗困境与新希望

尤文肉瘤是一种主要侵袭儿童和青少年骨骼的恶性肿瘤，如同隐匿在暗处的 “恶魔”，严重威胁着年轻患者的生命健康。目前，国际上多采用标准化疗、放疗和手术相结合的治疗方案，虽能使 3 年总生存率达到 82%，但对于转移性疾病、轴向骨骼局部疾病以及一线治疗耐药的患者来说，预后依旧极为严峻，他们急需更有效的治疗手段来延续生命的希望。

在探寻尤文肉瘤治疗新策略的征程中，EWS_R1::FLI₁融合癌蛋白成为了关键突破口。它由染色体易位产生，是尤文肉瘤的特征性分子标志，如同肿瘤生长的 “引擎”，在肿瘤的发生发展过程中发挥着核心作用。它能调控数百个基因的表达，促进癌细胞疯狂增殖，同时阻断细胞分化，还会改变癌细胞的表观遗传程序，让肿瘤变得更加 “顽固”。因此，精准靶向灭活 EWS_R1::FLI₁基因，成为了攻克尤文肉瘤的关键所在。

西班牙的研究人员肩负着攻克尤文肉瘤的使命，开展了一项极具创新性的研究。他们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，在尤文肉瘤特异性的 GGAA 启动子驱动下，实现了对 EWS_R1::FLI₁基因的靶向灭活。研究结果令人振奋，不仅在体外实验中成功抑制了尤文肉瘤细胞的增殖，还在体内实验中显著减缓了肿瘤的生长。这一成果为尤文肉瘤的治疗开辟了新的道路，发表在《Cancer Gene Therapy》杂志上，为全球的科研人员和患者带来了新的希望。

研究技术方法

研究人员为了开展此项研究，运用了多种关键技术。细胞培养技术方面，培养了多种细胞系，包括尤文肉瘤细胞系 A673、MHH-ES1 等，为实验提供了研究对象。基因编辑技术上，借助 CRISPR/Cas9 系统，对 EWS_R1::FLI₁基因进行精准编辑。同时，通过构建含有特定启动子和目的基因的质粒，如 GGAAprom 驱动的 Cas9 质粒，实现基因的定向表达。在病毒载体技术上，利用慢病毒和腺病毒作为载体，将目的基因导入细胞，其中腺病毒在体内外实验中发挥了重要作用。此外，还运用了免疫组化、Western blot、基因测序等技术，用于检测基因表达、蛋白水平以及基因编辑效果。

研究结果

1. GGAAprom 启动子的特异性激活：研究人员克隆了含有 GGAA 重复序列和 TATA 盒的 GGAAprom 序列，并将其构建到荧光素酶报告载体中。通过转染实验发现，EWS_R1::FLI₁能够强烈激活 GGAAprom，使其荧光素酶活性相比基础背景提升近 200 倍，而天然 FLI₁的激活作用较弱。进一步通过慢病毒感染构建稳定细胞系实验表明，GGAAprom 在表达 EWS_R1::FLI₁的尤文肉瘤细胞系（如 A673、MHH-ES1）中可高效激活荧光素酶表达，但在表达天然 FLI₁的 HT1080 细胞中则无此效果，这充分证明了 GGAAprom 对 EWS_R1::FLI₁的高度特异性。
2. Cas9 在尤文肉瘤细胞中的表达及对细胞增殖的影响：构建 GGAAprom>Cas9 和 GGAAless>Cas9 慢病毒载体，感染细胞后发现，Cas9 在 A673 和 MHH-ES1 尤文肉瘤细胞中，只有在 GGAAprom 驱动下才会表达。当这些细胞感染靶向 FLI₁外显子 9 的 gRNA 慢病毒时，细胞增殖受到显著抑制，降低幅度超过 95%；而感染靶向 FLI₁外显子 2 的 gRNA 慢病毒则无明显影响。在 HT1080 细胞中，无论感染何种 gRNA，细胞增殖均不受影响，这表明在尤文肉瘤细胞中，Cas9 与靶向 FLI₁外显子 9 的 gRNA 联合使用，可有效阻断细胞增殖。
3. 腺病毒作为基因治疗载体的可行性：为探索更适合临床应用的基因治疗载体，研究人员使用携带不同报告基因的腺病毒感染多种细胞系。结果显示，腺病毒能高效感染尤文肉瘤细胞和其他细胞系。在感染携带荧光素酶基因的腺病毒后，尤文肉瘤细胞在 GGAAprom 驱动下表现出高荧光素酶活性，而非尤文肉瘤细胞则活性极低。体内实验也表明，静脉注射携带荧光素酶基因的腺病毒后，Ad-GGAAprom>LUC2 在正常组织中几乎无荧光素酶活性，而 Ad-EF1A>LUC2 在肝脏、脾脏等组织中有较高活性，这证明基于 GGAAprom 的基因治疗对尤文肉瘤细胞具有高度特异性，且腺病毒可有效感染体内的尤文肉瘤细胞。
4. 腺病毒介导的基因治疗对尤文肉瘤细胞的治疗效果：构建携带 Cas9 基因和靶向 FLI₁外显子 9 gRNA 的腺病毒（Ad-GGAAprom>Cas9/gRNA EX9），感染尤文肉瘤细胞系 A673、SK-N-MC 和纤维肉瘤细胞系 HT1080。结果发现，Ad-GGAAprom>Cas9/gRNA EX9 显著抑制了尤文肉瘤细胞的增殖，对 EWS_R1::FLI₁蛋白水平以及其靶基因 CD44 和 NR0B1 的表达产生明显影响，同时使细胞呈现衰老形态。在体内实验中，低剂量（1×10⁹VP / 剂量）的 Ad-GGAAprom>Cas9/gRNA EX9 对肿瘤生长影响不显著，而高剂量（5×10¹⁰VP / 剂量）则可显著减缓肿瘤生长，降低肿瘤细胞增殖标记物 Ki67 阳性细胞的比例，且基因编辑率与肿瘤生长抑制呈正相关。

研究结论与意义

这项研究成功开发出一种高度特异性的基因治疗方法，能够永久性灭活尤文肉瘤细胞中的 EWS_R1::FLI₁基因。GGAAprom 启动子的应用，使基因治疗在尤文肉瘤细胞中具有高度特异性，极大地降低了对正常细胞的潜在影响。尽管在向临床转化的过程中，还需要进一步优化腺病毒载体的剂量、探索更有效的给药途径等，但该研究成果为尤文肉瘤的治疗提供了全新的方向和理论依据，有力地推动了基于基因编辑技术的癌症治疗领域的发展，让我们在战胜尤文肉瘤的道路上迈出了坚实的一步。未来，随着研究的不断深入，有望为更多尤文肉瘤患者带来治愈的希望。