功能性纳米酶系统：通过激活铜死亡和铁死亡实现协同肿瘤免疫治疗

为解决肿瘤铜代谢失调及缺氧微环境阻碍治疗的问题，研究人员开发 CussOMEp 系统，显著抑制肿瘤转移。

　　

一、研究背景

在癌症研究领域，金属离子尤其是铜离子，近年来成为了备受瞩目的焦点。铜离子在肿瘤的发生发展中扮演着极为复杂的角色，它既能促进肿瘤细胞的生长，又能在达到一定浓度时触发细胞死亡，其中铜死亡（cuproptosis）和铁死亡（ferroptosis）就是两种由铜离子参与引发的细胞死亡方式。铜死亡是指铜离子诱导的蛋白质毒性应激，会导致三羧酸循环中脂酰化蛋白质聚集，进而使铁硫簇蛋白丧失功能；铁死亡则以脂质过氧化为特征，由氧化应激触发，在多种恶性肿瘤的细胞死亡过程中发挥关键作用。而且，这两种细胞死亡方式都与免疫原性反应相关，有望增强抗肿瘤免疫力。

然而，理想很丰满，现实却很骨感。肿瘤细胞中铜代谢的失调成为了阻碍治疗的一大难题。肿瘤细胞为了满足自身异常增殖的需求，对铜离子的摄取量远高于正常细胞，同时它们还会高表达铜离子转运蛋白，如铜转运 ATP 酶 1（ATP7A），这种蛋白就像一个 “守门员”，在铜离子浓度升高时，会将多余的铜离子转运出细胞，维持细胞内铜离子的稳态平衡，使得铜离子难以在细胞内积累并发挥其细胞毒性作用。

不仅如此，肿瘤细胞及其微环境中高浓度的谷胱甘肽（GSH）也在从中作梗。GSH 作为一种强大的还原剂，不仅能够降低细胞内的活性氧（ROS）水平，还能作为谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）的辅助因子，抑制铁死亡的发生；同时，它还能像 “胶水” 一样与铜离子结合，阻碍铜死亡的进程。更为棘手的是，实体肿瘤普遍存在的缺氧微环境，不仅进一步削弱了针对铜死亡和铁死亡的治疗效果，还营造了一个抑制免疫反应的环境，让免疫系统难以发挥作用。

面对这些重重挑战，开发创新的治疗策略迫在眉睫。在此背景下，福建师范大学等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究，致力于突破肿瘤治疗的困境，相关成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上。

二、研究方法

研究人员开发了一种名为 CussOMEp 的功能性纳米酶系统，该系统整合了基于铜的纳米载体（CussNV）和铜转运抑制剂奥美拉唑（omeprazole，OME）。研究过程中运用了多种技术方法，如化学合成技术来制备 CussNV 和 CussOMEp，通过透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、X 射线衍射（XRD）等多种表征技术对合成的纳米材料进行结构和性能分析；利用细胞实验和动物实验，检测细胞摄取、细胞毒性、细胞内铜离子浓度等指标，评估纳米酶系统的治疗效果；采用密度泛函理论（DFT）模拟，从原子层面探究铜离子与二硫代二甘醇酸分子之间的配位相互作用。

三、研究结果

1. CussOMEp 的合成与表征：CussNV 通过二硫代二甘醇酸中的二硫键（S-S）与铜离子（Cu²⁺）配位合成。TEM 图像显示其呈不规则形态且粒径较小，DFT 模拟表明铜原子与二硫代二甘醇酸分子主要通过羧基（-COOH）和硫原子配位，电子密度等表面显示铜离子周围电子密度较高，存在 Cu²⁺向 Cu⁺转化的可能。BET 分析显示 CussNV 具有一定的孔体积和表面积，具备良好的载药能力。XPS 分析确定了其化学组成和价态，成功合成 CussNV。之后，通过简单搅拌负载 OME 并进行 PEG 化，制备出 CussOMEp。TEM 和 AFM 图像表明修饰未改变其结构，CussOMEp 纳米片厚度小于 1.5nm。CussOMEp 的 zeta 电位为 -11.36mV，UV-vis 吸收光谱显示 OME 特征峰，计算出其包封率约为 18%，FTIR 光谱进一步证实了修饰和 OME 的成功负载。此外，CussNV 在 pH 和 GSH 响应下可降解，CussOMEp 在 pH 6.0 时铜离子和 OME 的释放率更高，实现了 pH 响应的肿瘤特异性治疗。
2. CussNV 的多酶模拟特性：CussNV 具有 GSH 氧化酶（GSHox）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）样活性。它能高效降低 GSH 水平，反应符合米氏动力学，K_m为 2.0mM，V_max为 2.34×10^-6mM s^-1；在 TMB 比色法中，显著增强 TMB 溶液在 655nm 处的吸光度，催化 H₂O₂转化为?OH，还能降解亚甲基蓝（MB）和氧化邻苯二胺（OPD），K_m为 8.3mM，V_max为 3.59×10^-6mM s^-1；同时，CussNV 能产生大量氧气，展现出 CAT 样活性。这些特性使其能够扩大 ROS 池，缓解肿瘤缺氧，为增强铁死亡、铜死亡和相关抗肿瘤免疫反应提供可能。
3. 奥美拉唑抑制铜排泄增强铜死亡：通过荧光标记的 CussNVp（CussNVp@FITC）与 4T1 细胞孵育实验，证实 4T1 细胞能有效摄取 CussNVp@FITC。OME 以浓度依赖的方式诱导细胞死亡，CLSM 观察发现 OME 单独处理时对细胞内 Cu²⁺含量影响较小，而 CussOMEp 处理组细胞内 Cu²⁺浓度显著升高，且未导致 ATP7A 分散或转位，促进了 Cu²⁺积累。CussOMEp 处理的细胞产生更多?OH，降低细胞内 GSH 水平，引发铁死亡和铜死亡，通过 Liperfluo 染色、Western blot 分析等实验得到证实。CCK-8 检测显示 CussOMEp 对 4T1 细胞活力的抑制作用强于 CussNVp，Annexin V-FITC/PI 检测表明 CussOMEp 诱导的细胞凋亡率显著高于 OME 和 CussNVp 组。
4. 体内生物分布：将 CussNVp 标记远红外荧光染料吲哚菁绿（ICG）得到 CussICGp，在 4T1 荷瘤小鼠体内进行生物分布实验。结果显示，CussICGp 在肿瘤区域迅速积累，4 小时达到峰值，而游离 ICG 的荧光信号在 8 小时后几乎消失，表明 CussNVp 具有出色的肿瘤靶向能力。另外，对肿瘤组织中 Cu²⁺水平的检测发现，CussOMEp 组肿瘤内 Cu²⁺水平最高，证实其在肿瘤内的铜离子积累能力更强。
5. 体内生物相容性：通过溶血试验和对 Balb/c 小鼠的长期监测评估 CussOMEp 的生物相容性。溶血试验中，不同浓度的 CussNVp 和 CussOMEp 溶血率均不超过 5%。在 90 天的监测期内，注射 CussOMEp 的小鼠与对照组（注射 PBS）相比，体重增长无显著差异，主要器官的内脏指数、血常规指标、肝肾功能指标均无明显差异，H&E 染色显示主要器官细胞形态正常，表明 CussOMEp 具有良好的生物相容性和生物安全性。
6. CussOMEp 引发抗肿瘤免疫反应：在 4T1 肿瘤小鼠模型中评估 CussOMEp 的协同治疗效果。结果显示，OME 单独治疗对肿瘤生长抑制作用不明显，CussNVp 能适度延缓肿瘤进展，而 CussOMEp 显著抑制肿瘤生长，治疗 14 天后肿瘤生长抑制率达到 71.6%。H&E 染色显示 CussOMEp 处理组肿瘤细胞损伤严重，IHC 染色表明 CussOMEp 能更有效地减轻肿瘤缺氧，诱导肿瘤细胞发生铜死亡和铁死亡。此外，CussOMEp 还能调节肿瘤微环境中的免疫细胞，促进巨噬细胞向 M1 型极化，抑制 M2 型巨噬细胞，增强树突状细胞（DC）成熟，激活辅助性 T 细胞（CD3⁺CD4⁺）和细胞毒性 T 淋巴细胞（CD3⁺CD8⁺），增加中性粒细胞（CD11b⁺F4/80⁺Ly6G⁺）和 B 细胞（B220⁺）的浸润，激活适应性和先天性免疫反应。
7. CussOMEp 联合免疫检查点阻断抑制转移：将 CussOMEp 与 PD-1 抗体（αPD-1）联合，在双侧肿瘤模型和肺转移模型中评估其抑制转移的效果。在双侧肿瘤模型中，联合治疗显著抑制了原发性和远处肿瘤的生长，延长了小鼠的生存期，增强了 DC 成熟，诱导巨噬细胞从 M2 型向 M1 型转变，减少调节性 T 细胞（Treg）比例，促进 T 细胞激活，增加效应记忆 T 细胞比例。在肺转移模型中，联合治疗显著抑制原发性肿瘤生长，几乎完全抑制肺转移，延长小鼠生存期，且无明显体重下降，展现出良好的安全性和有效性。

四、研究结论与意义

本研究成功开发了 CussOMEp 功能性纳米酶系统，通过诱导铜死亡和铁死亡增强肿瘤免疫治疗效果。该系统不仅促进肿瘤细胞内的氧化应激和细胞毒性，还能调节肿瘤微环境，缓解缺氧并消耗 GSH。CussOMEp 的多种酶活性使其能够有效杀伤肿瘤细胞，抑制铜转运蛋白 ATP7A，增强铜离子积累，促进铁死亡和铜死亡，引发强烈的免疫原性反应。与 αPD-1 联合治疗时，CussOMEp 显著抑制肿瘤转移，激活免疫细胞，为克服肿瘤铜代谢失调和缺氧微环境带来的治疗限制提供了一种有前景的策略，为协同肿瘤免疫治疗开辟了新途径，有望推动癌症治疗领域的进一步发展。