褪黑素对镉诱导精原细胞铁死亡的保护作用及机制研究

为探究褪黑素（Mel）对镉（Cd）诱导精原细胞（spg）铁死亡的保护作用，研究发现 Mel 可缓解铁死亡，为治疗 Cd 诱导的睾丸损伤提供依据。

　　

研究背景：男性生育力下降背后的 “元凶” 探寻

在当今社会，男性生育力下降已成为一个不容忽视的健康问题。全球精子数量近十年来加速下滑，从 1973 年到 2018 年，年轻男性的总精子数从 33.57 亿减少到 12.66 亿，每年下降 1.4%，总体降幅达 62.3% 。欧洲男性的精子浓度在过去 50 年也呈下降趋势，整体减少了 32.5%。这一现象严重威胁着男性的生殖健康，也促使科研人员深入探寻背后的原因。

众多研究表明，环境因素在精子质量下降中扮演着重要角色。镉（Cd）作为一种常见的有毒重金属，能够轻松穿透血睾屏障，对睾丸细胞造成损害，进而降低精子数量，影响精子的产生过程（精子发生）。Cd 可通过多种机制诱导氧化应激和细胞死亡，引发生殖毒性，例如损伤支持细胞（Sertoli cells）和间质细胞（Leydig cells）。已有研究发现，Cd 能通过 m⁶A 甲基化的线粒体蛋白稳态应激或激活 AIM2 炎性小体途径诱导睾丸细胞焦亡；低剂量的 Cd 暴露还会导致 Parkin 易位和线粒体融合障碍，减少睾丸睾酮的合成。此外，研究还发现铁过载诱导的铁死亡（ferroptosis）与 Cd 导致的精子数量下降有关，且 NCOA4 介导的铁自噬（ferritinophagy）与 Cd 诱导的精原细胞铁死亡相关。

褪黑素（Melatonin，Mel）作为一种由松果体和视网膜分泌的吲哚胺神经激素，具有多种生理功能，如调节昼夜节律、改善睡眠、增强免疫力和延缓衰老等。它还是一种内源性抗氧化剂，能够清除体内自由基，维持细胞内活性氧（ROS）的代谢平衡。近年来，Mel 在生殖医学领域的作用逐渐受到关注，它对卵泡形成、精子发生、卵母细胞成熟等过程至关重要，能够提高受精率，促进胚胎发育，改善体外受精和胚胎移植的结果。鉴于此，研究人员推测 Mel 或许能对 Cd 诱导的精原细胞铁死亡起到保护作用，于是开展了相关研究。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究方法：揭秘细胞内的 “神秘反应”

研究人员以小鼠来源的精原细胞系 GC-1 spg 为研究对象，构建了体外细胞模型。实验分为四组：对照组（Control）、Mel 组、Cd 组和 Mel + Cd 组。在实验过程中，运用了多种技术方法来深入探究 Mel 对 Cd 诱导的精原细胞铁死亡的影响。

为了评估细胞活性，研究人员采用增强型细胞计数试剂盒 - 8（CCK-8）检测法。该方法通过在细胞培养体系中加入 CCK-8 工作溶液，经过一定时间的孵育后，利用酶标仪测定特定波长下的吸光度，以此来反映细胞的活性情况。

在观察线粒体超微结构时，研究人员先使用 2.5% 戊二醛溶液对细胞进行固定，再经过一系列处理，包括细胞刮取、离心、1% 四氧化锇固定、梯度酒精脱水、包埋、切片以及 2% 醋酸铀和 2.6% 柠檬酸铅溶液染色，最后通过透射电子显微镜（TEM）进行观察。

线粒体膜电位（MMP）的检测则借助 JC-1 荧光探针。细胞经不同处理后，与 JC-1 荧光探针在 37℃避光孵育 20 分钟，洗涤后利用流式细胞仪检测荧光强度，通过计算 JC-1 单体与聚集体的荧光强度比值来评估 MMP 的变化。

转录组学分析是该研究的关键技术之一。研究人员首先利用 TRIzol 提取细胞中的 RNA，将其存储于超低温冰箱后，送至专业公司进行 RNA 文库构建。随后，在相关平台上对所得结果进行差异基因表达分析和可视化处理，筛选差异表达基因的标准通常设定为 | FC|>2 且 P<0.05 。

此外，研究人员还通过多种实验方法检测了细胞内的总铁、亚铁离子、ROS、MDA、SOD、GSH、H₂O₂等指标，并运用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western blot）分别检测基因和蛋白的表达水平，利用免疫荧光技术对相关蛋白进行定位和检测。

研究结果：Mel 的 “神奇守护力”

1. Mel 缓解 Cd 诱导的损伤并减少精原细胞中的自噬体：研究人员首先考察了 Mel 对精原细胞活性的影响，结果显示低剂量的 Mel 对细胞活力无显著影响，而 100 μM 和 200 μM 的 Mel 会使细胞活力略有下降。进一步研究发现，Cd 会显著降低细胞活力，而低剂量的 Mel 能部分恢复 Cd 导致的细胞活力降低，其中 10 μM 的 Mel 保护效果最佳。通过 TEM 观察发现，Cd 会导致线粒体肿胀、变形、嵴断裂，同时使细胞内出现许多自噬体。Mel 预处理则能显著恢复 Cd 诱导的线粒体超微结构损伤，减少自噬体的数量。此外，Cd 暴露会降低 MMP，Mel 预处理则能增强被 Cd 降低的 MMP。这些结果表明，Mel 能够减轻 Cd 对精原细胞的损伤，保护精原细胞免受 Cd 诱导的毒性。
2. 转录组学分析揭示 Mel 缓解 Cd 诱导的自噬和铁死亡：转录组学分析结果显示，与对照组相比，Cd 处理组有 2429 个基因上调，1080 个基因下调；Mel + Cd 组与 Cd 组相比，有 782 个基因表达增加，2240 个基因表达减少。研究人员重点关注了铁死亡和自噬信号通路相关基因，发现 Cd 处理会使铁死亡相关基因（如 Gpx4、Fth1、Fsp1、Tfrc、Ptgs2、xCT、Hmox1）和自噬相关基因（如 Lc3b、Atg5、Atg7、Ncoa4）的表达发生显著变化，而 Mel 预处理能够逆转这些变化。这表明 Cd 可能激活精原细胞中的铁死亡和自噬信号通路，Mel 则可通过对抗 Cd 诱导的铁死亡和自噬来保护精原细胞。
3. Mel 改善 Cd 诱导的精原细胞铁代谢紊乱：已知铁代谢失调是铁死亡的一个重要特征，研究人员评估了与铁代谢相关的指标。结果发现，Cd 会显著增加细胞内 Fe²⁺和总铁水平，同时使铁蛋白重链 1（FTH1）、血红素加氧酶 1（HO1）的表达增加，而参与铁转运的关键蛋白 FPN1 和 TFR1 以及 Dmt1 的表达下降。Mel 预处理则能有效对抗这些变化，减少 Cd 诱导的铁积累。
4. Mel 减轻 Cd 诱导的氧化应激：研究结果表明，Cd 会使细胞内 ROS 水平升高，刺激精原细胞产生过多的 H₂O₂，导致丙二醛（MDA）水平显著升高，同时降低谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，减少 SOD2 的 mRNA 表达，增加 COX2 的 mRNA 和蛋白表达。而 Mel 能够显著减轻这些由 Cd 引起的变化，表明 Mel 可减轻 Cd 诱导的氧化应激，保护精原细胞免受铁死亡。
5. Mel 通过抑制 NCOA4 减轻 Cd 诱导的铁自噬：NCOA4 是一种与自噬相关的货物受体，可特异性结合铁蛋白，促进 FTH 降解，释放大量亚铁离子。TEM 和转录组学分析显示，Cd 会导致精原细胞发生自噬，增加 ATG5、LC3B 和 NCOA4 的表达。Mel 预处理则能抑制 Cd 诱导的这些基因和蛋白表达的上调，同时逆转 Cd 诱导的 LC3B 和 NCOA4 荧光增强。这表明 Mel 预处理可能通过抑制 Cd 诱导的铁自噬来改善铁代谢紊乱。

研究结论与讨论：开启男性生殖健康保护的新征程

综合上述研究结果，研究人员得出结论：Mel 能够改善铁代谢，通过调节铁离子的储存和输出、抑制 HO1 活性、减弱芬顿反应（Fenton reaction）以及减少 ROS 的产生，缓解 Cd 诱导的精原细胞铁死亡。此外，Mel 还能通过抑制 NCOA4/FTH1 介导的铁自噬，减轻铁死亡，保护精原细胞免受 Cd 毒性的影响。这表明 Mel 是预防和治疗 Cd 诱导的男性生殖系统损伤的有效手段。

在讨论部分，研究人员指出，Mel 作为一种具有多种生理功能的神经激素，在生殖医学领域的作用日益受到重视。以往研究发现，Mel 可通过多种机制预防和治疗生殖系统疾病，如抑制线粒体自噬预防 Cd 诱导的胎儿生长迟缓，减轻细胞焦亡缓解 1,2 - 二氯乙烷（1,2 - DCE）引起的睾丸毒性等。本研究进一步揭示了 Mel 在 Cd 诱导的精原细胞铁死亡中的保护机制，为 Mel 在男性生殖健康领域的应用提供了更坚实的理论基础。

铁过载在多种慢性疾病中普遍存在，与神经退行性疾病、肿瘤、肝脏疾病、肾脏疾病、眼部疾病等密切相关。Mel 及其代谢产物能够与铁离子结合，消除自由基，抑制 ROS，有望成为减轻铁毒性的新型药物。本研究不仅为治疗 Cd 诱导的睾丸损伤提供了潜在的治疗靶点和理论依据，也为后续研究 Mel 在其他铁过载相关疾病中的作用奠定了基础，具有重要的科学意义和临床应用前景。