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为解决 iPS 细胞免疫原性问题，研究人员敲除 HLA 基因，获低免疫原性 iPS 细胞克隆 A7，意义重大。
在细胞治疗的广阔领域中，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS 细胞）凭借其独特的多能性，成为了极具潜力的 “种子选手”。它能够分化为各种细胞类型，为众多疾病的治疗带来了新的希望。然而，免疫原性这一 “拦路虎” 却严重阻碍了 iPS 细胞在异基因治疗中的应用。当 iPS 细胞被用于异基因治疗时，患者的免疫系统会将其识别为外来物，进而发动攻击，导致治疗失败。这就好比在细胞的 “战场” 上，iPS 细胞无法顺利 “安营扎寨”，无法发挥其治疗作用。
为了攻克这一难题，来自韩国 YiPSCELL Inc. 等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Experimental & Molecular Medicine》杂志上，为 iPS 细胞的临床应用带来了新的曙光。
研究人员主要运用了 CRISPR-Cas9 基因编辑技术。这一技术就像是一把精准的 “分子剪刀”，能够对特定基因进行切割和编辑。研究人员利用它来敲除与免疫反应密切相关的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因，包括 HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRA 基因，旨在打造低免疫原性的通用 iPS 细胞。
在研究设计方面，研究人员选用了具有 HLA 基因杂合等位基因的 YiP3 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）来源的 iPS 细胞。他们针对 HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRA 基因设计了引导 RNA（guide RNA，gRNA），并通过电穿孔的方法将 CRISPR-Cas9 试剂导入 iPS 细胞中，实现基因敲除。随后，进行单细胞克隆和筛选，最终获得了多个潜在的三基因敲除（triple-KO）克隆。
在对这些克隆的评估中，研究人员发现，克隆 A7 和 B2 在多能性方面表现出色。它们在形态上能够形成典型的克隆集落，碱性磷酸酶染色呈阳性，表明处于未分化状态。在 mRNA 和蛋白质水平上，多能性标记物如八聚体结合转录因子 4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）、性别决定区 Y 框蛋白 2（sex-determining region Y box 2，SOX2）等表达正常，且能够成功分化为三个胚层的细胞，这意味着它们保留了 iPS 细胞的核心特性。
进一步研究 HLA 基因表达情况时，发现克隆 A7 和 B2 在基因编辑后，HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRA 的 mRNA 表达显著降低。经干扰素 γ（interferon gamma，IFN-γ）刺激后，蛋白质水平上 HLA-A、HLA-B 和 HLA-DR 的表达也明显减少，而 HLA-C 的表达不受影响，这表明成功实现了对目标基因的选择性敲除。
遗传稳定性是评估 iPS 细胞能否用于临床的关键因素。研究人员对克隆 A7 和 B2 进行了全面的遗传稳定性分析。结果显示，克隆 A7 具有正常的核型，且在长期体外培养过程中，未检测到与脱靶效应相关的拷贝数变异（copy number variations，CNVs）和体细胞编码变异，转录组也保持稳定。而克隆 B2 则存在一些问题，如基因组不稳定、与细胞发育相关基因的下调等，因此被排除在最终的候选克隆之外。
免疫原性测试是验证研究成果的重要环节。研究人员将克隆 A7、B2 与不同 HLA 类型的外周血单个核细胞（PBMC）进行共培养实验。结果发现，与未编辑的 YiP3 细胞相比，克隆 A7 能够显著降低效应记忆 T 细胞（effector memory T cell，TEM）和中枢记忆 T 细胞（central memory T cells，TCM）的增殖，同时也能明显降低自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）的活性，这充分证明了克隆 A7 具有低免疫原性。
此外，研究人员还对克隆 A7 的分化能力进行了深入研究。将其分化为内皮细胞（endothelial cells，ECs）、感觉神经元（sensory neurons，SNs）和肝细胞（hepatocytes，Heps）后发现，克隆 A7 能够正常分化，且分化后的细胞表达相应的标记物，同时 HLA-A、HLA-B 和 HLA-DRA 的表达持续下调。
综上所述，研究人员成功获得了低免疫原性的 iPS 细胞克隆 A7。它不仅保留了 iPS 细胞的多能性和分化能力，还具备良好的遗传稳定性和低免疫原性。这一成果为 iPS 细胞在细胞治疗和 iPS 细胞衍生类器官治疗的应用提供了重要的理论基础和实践依据，有望推动相关领域的临床发展，为更多患者带来新的治疗选择。
