茉莉酸与脱落酸协同调控植物插条再生研究取得重要进展

本文揭示了拟南芥离体叶片在渗透胁迫下，茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）途径协同调控根系再生的机制。

　　### 茉莉酸与脱落酸协同调控植物插条再生研究取得重要进展
在植物的生长繁衍过程中，扦插繁殖是一种重要的无性繁殖方式，其中插条的根系再生能力直接影响着繁殖的成功率。然而，在实际的扦插过程中，离体的叶片或茎段（即外植体）在根系再生过程中会面临诸多压力，比如水分供应中断、伤口直接暴露于外界环境导致的干旱、渗透和盐胁迫等。因此，探究植物在压力条件下插条根系再生的分子机制，对于提高扦插繁殖效率具有重要意义。近期，一项关于茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）在植物插条再生过程中作用机制的研究取得了重要进展，为我们深入理解植物的再生能力提供了新的视角。

研究背景与目的

在扦插繁殖中，拟南芥离体叶片在培养基上培养时能够在伤口处再生不定根，这一过程被称为从头（de novo）根再生。此前研究发现，拟南芥离体叶片在受伤后，伤口和压力相关的通路会被上调，其中包括 JA 和 ABA 信号通路。虽然已有研究表明 JA 介导的伤口信号通路参与了植物再生，ABA 也在植物的应激反应和组织培养中发挥着关键作用，但它们在压力条件下如何协同保护植物再生的机制仍不明确。本研究旨在揭示在压力条件下，JA 和 ABA 信号通路对拟南芥离体叶片根系再生的调控机制，为提高植物扦插繁殖效率提供理论依据。

研究方法

1. 设置渗透胁迫处理：研究人员将野生型拟南芥哥伦比亚 - 0（Col - 0）的离体叶片培养在含有不同浓度甘露醇的 B5 培养基上，以模拟不同程度的渗透胁迫。甘露醇浓度从 0 mM（作为对照，即 mock 处理）到 400 mM 不等，其中 10 mM 和 50 mM 为轻度胁迫，100 mM 和 200 mM 为中度胁迫，400 mM 为重度胁迫。通过观察叶片在不同胁迫条件下的生根情况，研究叶片对渗透胁迫的耐受性以及压力对根系再生的影响。
2. RNA 测序（RNA - seq）分析：对在 mock 和 50 mM 甘露醇（轻度渗透胁迫）条件下培养的野生型 Col - 0 离体叶片进行 RNA - seq 实验，在叶片离体后的 0（t₀）、30 分钟、2 小时和 4 小时收集样本，以鉴定响应伤口和压力的候选基因。同时，对在轻度渗透胁迫下的 Col - 0、JA 信号通路突变体（如 coronatine insensitive 1 - 2，coi1 - 2；myc2 - 3）和 ABA 信号通路突变体（如 ABA INSENSITIVE5，abi5 - 7）的离体叶片进行 RNA - seq 分析，以确定受 MYC2 - ABI5 激活且参与保护再生的基因。
3. 基因功能验证：通过构建多种突变体和过表达植株，如 ABA 生物合成途径突变体 aba deficient2 - 1（aba2 - 1）、ABA 信号通路突变体 abi5 - 7、JA 信号通路突变体 coi1 - 2 和 myc2 - 3、ABA 代谢途径突变体 bglu18 - 1 以及 BGLU18 过表达植株（35S_pro:3×FLAG - BGLU18）等，分析这些突变体和过表达植株的离体叶片在 mock 和轻度渗透胁迫条件下的根系再生能力，从而验证相关基因在压力条件下对根系再生的作用。
4. 蛋白质互作分析：运用酵母双杂交、免疫共沉淀（coIP）和 pull - down 等实验技术，检测 MYC2 和 ABI5 之间是否能够形成蛋白质复合物。通过染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq）和 ChIP - qPCR 实验，确定 MYC2 是否能够直接结合到 BGLU18 基因的启动子区域，进而调控其表达。

研究结果

1. 拟南芥离体叶片对渗透胁迫的耐受性：研究发现，拟南芥野生型离体叶片能够耐受轻度渗透胁迫（10 mM 和 50 mM 甘露醇），几乎所有叶片都能在该条件下再生根系；在中度渗透胁迫（100 mM 和 200 mM 甘露醇）下，约一半的叶片可以再生根系；而在重度渗透胁迫（400 mM 甘露醇）下，叶片无法再生根系。这表明拟南芥离体叶片具有一定的抵抗轻度和中度渗透胁迫的能力，且这种能力与根系再生密切相关。
2. 关键基因的表达变化：RNA - seq 分析结果显示，在伤口和渗透胁迫处理后，有 2936 个候选伤口 / 压力响应基因被鉴定出来，这些基因可分为 3 个簇。基因本体（GO）富集分析表明，它们在对 JA 和 ABA 的响应以及多种压力条件下发挥潜在作用。其中，JA 信号通路转录因子基因 MYC2、ABA 信号通路转录因子基因 ABI5 以及编码 β - GLUCOSIDASE18 的基因 BGLU18 分别在不同簇中被鉴定出来。进一步通过定量逆转录聚合酶链反应（RT - qPCR）验证发现，MYC2 在切割后 30 分钟开始上调，且在轻度渗透胁迫下的表达水平显著高于 mock 条件；ABI5 在 mock 条件下 30 分钟时上调，在轻度渗透胁迫下从 30 分钟开始逐渐上调，4 小时达到峰值，且各时间点的转录水平均显著高于 mock 条件；BGLU18 在叶片离体后 2 小时和 4 小时上调，且在轻度渗透胁迫下 2 小时时的转录水平显著高于 mock 条件。此外，MYC2 的上调部分依赖于 JA 和 ABA 信号通路。
3. 相关基因对根系再生的重要性：对多种突变体离体叶片的根系再生能力分析表明，在 mock 条件下，除 coi1 - 2 叶片外植体再生能力较低（可能与 COI1 参与伤口促进的生长素产生有关），其他突变体（如 aba2 - 1、abi5 - 7、myc2 - 3、bglu18 - 1）与野生型 Col - 0 的叶片外植体生根比例相似。然而，在轻度渗透胁迫条件下，所有 ABA 和 JA 途径突变体的生根能力均显著降低，这表明 ABA 和 JA 途径对于植物在压力条件下的再生过程至关重要。同时，myc2 - 3 abi5 - 7 双突变体表现出比单个突变体更严重的生根缺陷。进一步研究发现，BGLU18 过表达能够部分挽救 myc2 - 3 和 abi5 - 7 叶片外植体的生根缺陷，且短暂的 ABA 处理可以增强 Col - 0 在中度渗透胁迫下的生根能力，部分挽救 aba2 - 1 和 myc2 - 3 叶片外植体在轻度渗透胁迫下的生根缺陷。这些结果表明，BGLU18 可能在 MYC2 和 ABI5 的下游发挥作用，且 ABA 水平的升高有助于植物在压力条件下的根系再生。
4. MYC2 - ABI5 复合物对 BGLU18 的调控：通过酵母双杂交、coIP 和 pull - down 分析，证实 MYC2 和 ABI5 能够形成蛋白质复合物。BGLU18 启动子包含 MYC2 结合序列（MBS，CACGTG）和 ABI5 结合的 ABA 响应元件（ABRE，PyACGTGGC）。ChIP - seq 和 ChIP - qPCR 实验表明，MYC2 可以直接结合到 BGLU18 基因的启动子区域。利用报告基因系（如 BGLU18_pro:GUS、m(abre)BGLU18_pro:GUS、m(mbs)BGLU18_pro:GUS 和 mmBGLU18_pro:GUS）和拟南芥原生质体实验进一步证实，MYC2 和 ABI5 可以通过 MBS 和 ABRE 协同激活 BGLU18 的表达。
5. JA 和 ABA 对插条生根能力的影响：在拟南芥叶片插条中，连续施加 JA 和 ABA 能够上调 BGLU18 的表达水平，挽救 bglu18 - 1 突变体在轻度渗透胁迫下的生根缺陷，同时增强 Col - 0 离体叶片在中度渗透胁迫下的生根能力，但在重度渗透胁迫下效果不明显。在杨树（Populus×euramericana cv. “74/76”）茎插条实验中，先将插条浸泡在 0.1 μM JA 中 10 分钟，冲洗后再浸泡在 5 μM ABA 中 2 小时，然后插入土壤中，结果显示这种连续处理显著增强了插条的生根能力，优于单独使用 JA 或 ABA 处理以及空白对照。

研究结论与意义

本研究通过一系列实验，揭示了在渗透胁迫条件下，拟南芥离体叶片中 JA 介导的伤口信号通路和 ABA 介导的应激信号通路协同保护植物再生的分子机制。具体而言，伤口和渗透胁迫会促使 MYC2 和 ABI5 基因表达上调，它们形成的复合物能够直接结合到 BGLU18 基因的启动子上，促进其表达。BGLU18 可以将 ABA 从 ABA 葡萄糖酯（ABA - GE）中释放出来，从而增加 ABA 的积累，进而保护植物在压力条件下的根系再生过程。这一研究成果为理解植物在逆境条件下的再生机制提供了重要的理论基础，同时也为提高植物扦插繁殖效率提供了潜在的应用策略，例如在农业生产中，可以通过合理调控 JA 和 ABA 的施加，提高插条的生根率，促进植物的繁殖和生长。此外，研究还发现了一些尚未明确的问题，如 JA 和 ABA 是否参与调控 ABI5 在叶片离体后的上调过程、升高的 ABA 水平保护植物再生的具体分子机制、ABRE 和 MBS 在功能上的区分以及 ABI5 与 BGLU18 启动子的结合方式等，这些问题为后续研究指明了方向，有望进一步深化我们对植物再生机制的认识。