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本文通过多种实验，揭示了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）阴道定植的关键基因及相关机制，为防控提供依据。
一、研究背景
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）作为一种机会致病菌，可在人体多个部位定植，其中阴道定植在孕期危害极大，会引发菌群失调、不良妊娠结局及侵袭性疾病等。研究发现，孕期 MRSA 阴道定植率约为 4%，其带来的垂直传播、产后感染等问题严重威胁母婴健康。此前虽有对 MRSA 阴道定植的研究，但大多聚焦单一因素，且研究不够深入。随着测序技术发展，开展全基因组筛选成为探索 MRSA 阴道定植机制的有效途径。本研究旨在利用转座子测序（Tn - seq）和 RNA 测序（RNA - seq）技术，深入挖掘 MRSA 阴道定植的关键基因和分子机制，为开发针对性防控策略提供理论依据。
二、研究方法
- 构建小鼠阴道定植模型：选用 8 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠，在同步发情周期后，将 MRSA 的 Tn 文库经阴道接种。分别在接种后 24 小时收集阴道灌洗液，72 小时收集灌洗液、阴道组织和宫颈组织，用于后续实验分析。
- Tn - seq 实验流程：对收集的样本进行处理，通过修改 Illumina DNA 制备试剂盒 protocol，富集 Tn - 基因连接点。将处理后的样本进行测序，分析测序数据，确定基因的插入位点和表达情况。利用 TRANSIT 软件进行数据分析，筛选出在阴道定植过程中具有重要作用的基因。
- RNA - seq 实验流程：培养野生型（WT）和 ΔsrrAB 突变体的 MRSA 菌株，在不同生长阶段和氧气条件下收集样本。提取 RNA 并进行测序，分析转录组数据，找出差异表达基因，探究 SrrAB 调控系统在 MRSA 阴道定植中的作用机制。
- 基因功能验证：选取 Tn - seq 和 RNA - seq 结果中具有代表性的基因，构建突变体菌株。通过与 WT 菌株共挑战实验和单挑战实验，验证这些基因在 MRSA 阴道定植过程中的功能。利用实时定量 PCR（RT - qPCR）技术，对相关基因的表达水平进行检测，进一步确认基因的调控机制。
三、研究结果
- Tn - seq 揭示的基因信息：通过 Tn - seq 分析，发现宫颈样本的插入位点显著低于输入样本，这可能与宫颈特殊的生理环境有关。在阴道定植过程中，共鉴定出 262 个显著低表达基因，这些基因主要涉及氨基酸代谢、核苷酸代谢、能量产生与转换、转录、辅酶代谢以及无机离子运输和代谢等功能类别。其中，qoxB、bshB2、nanE 和 SrrAB 等基因在阴道定植中表现出重要作用。
- 关键基因对 MRSA 竞争适应性的影响：通过共挑战实验证实，qoxB、bshB2 和 nanE 突变体在小鼠阴道定植中竞争力明显弱于 WT 菌株。qoxB 参与有氧呼吸，其突变体影响能量产生；bshB2 参与芽孢硫醇（BSH）生物合成，对抵抗氧化应激至关重要；nanE 在唾液酸代谢中起关键作用，影响 MRSA 对特殊碳源的利用。SrrAB 双突变体在与 WT 菌株共挑战时，72 小时内即被完全竞争淘汰；在单挑战实验中，前期定植情况与 WT 相似，但 9 天后迅速被清除，表明 SrrAB 对 MRSA 在阴道中的定植和持续存在至关重要。
- RNA - seq 分析 SrrAB 调控基因：RNA - seq 实验表明，在低氧条件下，WT 与 ΔsrrAB 突变体之间差异表达基因数量最多。这些差异表达基因涉及呼吸链维持、氨基酸和无机离子运输等多个功能。通过比较分析，确定了 30 多个可能与阴道定植适应性相关的 SrrAB 调控基因，为深入理解 MRSA 在阴道环境中的生存机制提供了重要线索。
- 综合分析确定关键基因：综合 Tn - seq 和 RNA - seq 数据，并结合之前的研究结果，确定了 19 个在 MRSA 阴道定植中具有重要作用的基因。这些基因包括参与嘌呤生物合成的 purE、与细胞呼吸相关的 qoxB 和 hemX 等。qPCR 验证结果显示，这些基因在 ΔsrrAB 突变体中的表达水平显著低于 WT 菌株，进一步证实了它们受 SrrAB 调控，且与 MRSA 阴道定植密切相关。
四、研究结论
- 关键基因和代谢途径：本研究成功鉴定出多个影响 MRSA 阴道定植的关键基因，如 qoxB、bshB2、nanE 和 SrrAB 等，以及相关代谢途径，包括有氧呼吸、BSH 生物合成、唾液酸代谢和转录调控等。这些基因和途径在维持 MRSA 在阴道环境中的竞争适应性和生存能力方面发挥着重要作用。
- SrrAB 调控系统的重要性：SrrAB 调控系统不仅参与 MRSA 的呼吸调控，还对氨基酸和无机离子运输等过程进行调节，从而影响 MRSA 在阴道中的定植和生存。研究结果为进一步理解 SrrAB 调控网络在 MRSA 致病机制中的作用提供了新视角。
- 研究意义和展望：本研究成果为深入了解 MRSA 阴道定植的分子机制奠定了基础，有助于开发针对 MRSA 感染的新型治疗策略和预防措施。未来研究可进一步探究这些基因的具体作用机制，以及它们与宿主免疫系统的相互作用，为改善女性生殖健康提供更有力的支持。
五、研究局限
尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一定局限性。Tn - seq 和 RNA - seq 技术本身存在一定缺陷，如 Tn - seq 难以识别群体共享因子，RNA - seq 可能遗漏调控范围窄的基因。此外，小鼠阴道定植模型无法完全模拟人类阴道环境，实验中未明确小鼠的微生物组组成，这可能影响对唾液酸代谢等表型的研究。未来研究需要克服这些局限，更深入地揭示 MRSA 阴道定植的机制。
