一种新型 RP-HPLC 法测定福沙那韦潜在杂质：方法开发与验证

研究人员开发出一种 RP-HPLC 法测定福沙那韦潜在杂质，该方法高效且经全面验证，意义重大。

　　在艾滋病治疗领域，福沙那韦（Fosamprenavir）作为一种蛋白酶抑制剂，在高效抗逆转录病毒治疗（HAART）方案中发挥着关键作用，它能抑制 HIV 蛋白酶的功能，阻碍病毒复制，从而延缓疾病进展。然而，药物中的杂质可能影响其安全性和有效性。目前，针对福沙那韦潜在杂质的分析方法存在局限性，现有的少数分析方法无法同时精准测定所有潜在杂质，且在灵敏度、线性范围等方面也有待提高。为了更好地监测福沙那韦的药物质量，保障患者用药安全，来自印度多所机构（GITAM 被视为大学、Saveetha 医学学院和医院、Raghavendra 制药教育与研究学院等）的研究人员开展了一项关于福沙那韦潜在杂质分析方法的研究。最终，研究人员成功开发出一种可靠且强大的反相高效液相色谱法（RP-HPLC），该研究成果发表在《BMC Pharmacology and Toxicology》上，这一成果对福沙那韦的质量控制和相关药物研发意义重大。

研究人员在开展研究时，主要运用了以下关键技术方法：首先是色谱分离技术，选用 Zobrax C18 柱，以 0.1% V/V 正磷酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱；其次是检测技术，在 264nm 波长下进行检测，柱温保持在 30±2°C；最后是溶液制备技术，采用水与乙腈比例为 1:1 的稀释剂来制备标准溶液和样品溶液。

研究结果主要围绕优化方法和方法验证展开：

• 优化方法：经过多次试验，确定了最佳的色谱条件，即使用 Zobrax C18 柱（100×4.6mm，5μm） 、以 0.1% v/v 正磷酸（OPA）水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱、流速为 1ml/min、检测波长为 264nm。在该条件下，福沙那韦、氨基（Amino）、丙基（Propyl）、异构体（Isomer）、硝基（Nitro）杂质和安普那韦（Amprenavir）杂质能够在 10 分钟内实现良好分离，保留时间（RT）分别为 5.3min、2.3min、4.3min、4.7min、8.1min 和 8.6min。
• 方法验证：
  • 系统适用性：通过连续 6 次进样含有 1ppm 福沙那韦、各杂质的标准溶液，评估理论塔板数、USP 分离度、拖尾因子和峰面积的相对标准偏差（% RSD）等参数，结果表明该方法系统适用性良好。
  • 线性：在 25 - 150% 标准溶液浓度范围内（0.5、0.75、1、1.25 和 1.5ppm）对福沙那韦及其相关杂质进行线性研究，每个浓度水平进样 3 次，计算得出 R2 值均为 0.999，显示出良好的线性关系。
  • 灵敏度：采用信噪比（S/N）法确定检测限（LOD）和定量限（LOQ），该方法对所有分析物的 LOD 和 LOQ 值都处于极低范围，展现出高灵敏度。
  • 特异性：分别进样单个杂质溶液、所有杂质加福沙那韦的混合溶液以及福沙那韦样品溶液，记录色谱图。结果显示，在福沙那韦和各杂质的保留时间处无干扰，证明该方法特异性良好。
  • 精密度：系统精密度通过进样 6 次标准溶液进行验证，方法精密度通过进样加标 0.1% 各杂质的福沙那韦样品溶液进行验证，两者的 % RSD 结果均在 0.5 - 1.7 之间，符合要求。
  • 准确度：采用加样回收试验，在福沙那韦样品溶液中加入不同浓度水平（LOQ、50%、100% 和 150%）的相关杂质，计算各杂质的平均回收率在 90.9 - 104.3% 之间，表明方法准确度高。
  • 稳健性：对流速（±0.1ml/min）、柱温（±2°C）和检测波长（±2nm）等参数进行微小改变，所得峰面积的 % RSD 值均在可接受范围内，证明方法稳健性良好。
  
  

研究结论表明，研究人员成功开发了一种简便高效的 RP-HPLC 法，可用于测定福沙那韦及其异构体、氨基、丙基、硝基和安普那韦杂质，无论是在原料药还是片剂形式中均适用。该方法具有洗脱时间短、精密度可重复、灵敏度高和特异性好等优点，在制药行业具有广泛的应用前景。在讨论部分，研究人员指出，相关物质（RS）HPLC 分析方法在药物研发和质量控制中至关重要，能够确保药品符合法规要求，保障产品安全、稳定和质量均一。与以往报道的方法相比，该研究开发的方法在灵敏度、线性范围和同时测定所有潜在杂质等方面具有明显优势，其验证参数结果满足国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q2 标准，充分证明了该方法的可靠性和有效性，为福沙那韦的质量监测和杂质评估提供了有力的技术支持，有助于推动相关药物的研发和质量控制，保障患者用药安全。