病毒介导活性肽表达抑制 ERK1/2 核功能，选择性调控记忆消退

研究人员构建病毒载体表达活性肽，抑制 ERK1/2 核功能，发现其选择性影响记忆消退，为相关疾病治疗提供新思路。

　　在生命科学领域，记忆的形成与消退机制一直是科学家们关注的焦点。从进化的角度看，记忆帮助生物适应环境、躲避危险，但不良记忆也会给生物带来困扰，比如人类的创伤后应激障碍（PTSD）就与恐惧记忆的异常消退密切相关。以往研究表明，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在记忆过程中发挥着关键作用，其中细胞外信号调节激酶 1/2（ERK1/2）更是这条通路的核心成员。然而，传统的基于小分子的药物虽然在药物研究中占据主导地位，但肽类抑制剂因其高特异性和低毒性等优势，逐渐成为研究热点。不过，肽类药物存在稳定性差和膜通透性低等问题，限制了其应用。为了突破这些困境，来自以色列海法大学的研究人员开展了一项创新性研究，相关成果发表在《Molecular Brain》上。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先是构建重组慢病毒载体，将脑源性神经营养因子（BDNF）或神经生长因子（NGF）的前体结构域与能抑制 ERK1/2 核转位的 EPE 肽序列融合；接着利用细胞系 COS7 和 HEK293FT 进行体外实验，验证载体功能；然后通过小鼠实验，在小鼠海马 CA1 区和前岛叶皮层（aIC）进行病毒载体注射，并运用恐惧条件反射和条件性味觉厌恶等行为学实验范式评估小鼠记忆情况；最后采用蛋白质免疫印迹（WB）、免疫荧光等技术检测相关蛋白的表达和定位。

研究结果如下：

1. 病毒介导的小肽递送和表达方法：研究人员设计并克隆了表达 BDNF/NGF 前体结构域编码序列的病毒载体，用 EPE 肽序列替换成熟蛋白编码区。在 COS7 细胞实验中，通过免疫荧光检测到病毒介导的肽前体表达，证实了载体的功能性。同时，用该载体处理 COS7 细胞后，发现转录因子 Elk1 的磷酸化水平降低，说明 EPE 肽能抑制 ERK1/2 的核功能。
2. EPE 对 COS7 细胞中 ERK 核转位的影响：合成的 EPE 肽预处理 COS7 细胞，经佛波酯（TPA）刺激后，通过 WB 检测发现其能降低细胞核 / 细胞质中 ERK1/2 的比值，抑制 ERK1/2 向细胞核转运。而病毒介导的 proBDNF-EPE 或 proNGF-EPE 表达同样能降低该比值，且长期的低水平 ERK1/2 核转位可能引发反馈调节，导致细胞中丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 - 3（MKP-3）水平升高。
3. proBDNF-EPE 慢病毒处理对小鼠恐惧消退的影响：研究人员将 proBDNF-EPE、proNGF-EPE 或 EGFP 慢病毒注射到小鼠海马 CA1 区，随后进行恐惧条件反射实验。结果发现，所有实验组小鼠在恐惧记忆获取和检索阶段表现相似，但在消退阶段，proBDNF-EPE 注射组小鼠的冻结率显著高于对照组，表明其恐惧消退受损。对 CA1 区组织的生化分析显示，proBDNF-EPE 组小鼠的 ERK1/2 及其核靶点 Elk1 和丝裂原和应激激活激酶 1（MSK1）的磷酸化水平降低，同时 GluR2 蛋白水平升高。
4. proBDNF-EPE 注射对小鼠条件性味觉厌恶消退的影响：在条件性味觉厌恶实验中，将 proBDNF-EPE 或 EGFP 慢病毒注射到小鼠岛叶皮层。结果显示，两组小鼠在条件性味觉厌恶获取和检索阶段的厌恶指数相似，但在消退阶段，proBDNF-EPE 注射组小鼠的厌恶指数更高，表明其条件性味觉厌恶消退受损。且恢复条件性味觉厌恶记忆后，两组小鼠的厌恶程度相似，进一步说明 ERK1/2 的核功能对消退学习至关重要。
5. 抑制 ERK 核转运对 CA1 神经元突触传递的影响：通过对表达 GFP 或 proBDNF-EPE 的 CA1 锥体神经元进行全细胞 patch clamp 记录，发现注射 EPE 肽的组中，微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）的频率显著增加，但幅度无明显差异，这表明抑制 ERK 核转位影响了突触活动。

研究结论和讨论部分指出，该研究开发了一种利用病毒载体表达靶向抑制肽的新方法，抑制 ERK1/2 核转位可选择性损害记忆消退，而不影响记忆获取和检索。这一发现为理解记忆的分子机制提供了新视角，也为治疗与记忆相关的神经精神疾病，如创伤后应激障碍、成瘾等，开辟了潜在的治疗方向。尽管该研究存在一些局限性，如未进行直接的 LV-EPE 比较，且长期抑制 ERK 可能激活补偿机制，但未来通过改进实验设计，如整合诱导型病毒系统，有望更精确地调控肽表达，优化治疗效果。总之，这项研究为肽类药物在神经系统疾病治疗中的应用提供了重要的理论依据和实践指导。