Atractylenolide I：治疗去势抵抗性前列腺癌的新希望

研究人员针对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）开展研究，发现 Atractylenolide I（ATR-I）可抑制 CRPC 细胞生长，为其治疗带来新方向。

　　去势抵抗性前列腺癌（CRPC）如同男性健康的 “隐形杀手”，在全球范围内，它已成为男性肿瘤相关死亡的主要原因之一。尽管前列腺特异性抗原（PSA）检测让前列腺癌（PCa）的早期诊断有了很大进步，但仍有部分患者确诊时已是局部晚期，5 年生存率较低。雄激素剥夺疗法（ADT）作为 PCa 的一线治疗策略，虽能暂时缓解病情，可大多数患者最终还是会发展为 mCRPC，中位生存期仅约 3 年。恩杂鲁胺（enzalutamide）作为一种有效的雄激素受体（AR）拮抗剂，已被美国食品药品监督管理局批准用于临床 CRPC 治疗，不过原发性或获得性耐药问题限制了其疗效，导致治疗失败。因此，寻找能与恩杂鲁胺联合使用、改善 PCa 预后的治疗佐剂迫在眉睫。

在这样的背景下，华中科技大学同济医学院附属同济医院的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦在 Atractylenolide I（ATR-I）上，这是一种从白术根茎中分离出的天然倍半萜内酯，在多种恶性肿瘤中展现出强大的抗癌潜力，且天然草药通常细胞毒性较低、副作用较少。此次研究成果发表在《Chinese Medicine》上，为 CRPC 的治疗带来了新的曙光。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，通过构建恩杂鲁胺耐药（EnzR）细胞系，利用 CCK - 8、EdU、伤口愈合、Transwell 实验、流式细胞术等检测细胞的增殖、迁移、凋亡等能力。在分子生物学实验中，运用 RNA 测序分析 ATR - I 处理后基因表达谱的变化，采用定量实时聚合酶链反应（qRT - PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blotting）、免疫沉淀（IP）等技术检测相关基因和蛋白的表达及变化。还构建了小鼠异种移植模型，直观观察 ATR - I 对肿瘤生长的影响。

研究结果如下：

1. ATR - I 抑制 CRPC 细胞的增殖和转移：研究人员选用 AR 阳性的 C4 - 2 和 AR 阴性的 PC - 3 两种 CRPC 细胞系进行实验。CCK - 8 实验表明，ATR - I 能以浓度和时间依赖的方式抑制 PCa 细胞活力，其半数抑制浓度（IC₅₀）在不同时间和细胞系中有差异。EdU 实验显示，ATR - I 显著降低两种细胞系中 EdU 阳性细胞的比例。伤口愈合实验和 Transwell 实验也证实，ATR - I 处理组的伤口愈合速度更慢，细胞转移能力明显受损。同时，Western blotting 结果表明，ATR - I 干预后，与上皮 - 间质转化（EMT）相关的蛋白 N - cadherin、Vimentin 和迁移侵袭标记蛋白 MMP9 的表达均降低。
2. ATR - I 诱导细胞周期停滞和凋亡：鉴于 ATR - I 对 CRPC 细胞生长的抑制作用，研究人员进行细胞周期实验。结果发现，ATR - I 刺激导致 PCa 细胞在 G₀/G₁期积累，S 期和 G₂/M 期细胞数量相应减少。Western blotting 检测到 ATR - I 抑制了 CyclinA2、CyclinD1 和 CDK2 等细胞周期相关蛋白的表达。流式细胞术分析还表明，ATR - I 处理后，CRPC 细胞的凋亡率显著增加。进一步研究发现，ATR - I 降低了 Caspase3 和 Bcl - 2 的表达，同时上调了 Cleaved - caspase3 的表达，这一系列结果表明 ATR - I 通过使细胞周期停滞在 G₁期并触发促凋亡活性，抑制了 CRPC 细胞的存活。
3. ATR - I 抑制恩杂鲁胺耐药细胞的生长：研究人员成功构建了恩杂鲁胺耐药的 C4 - 2B - EnzR 细胞系，CCK - 8 和 EdU 实验结果显示，ATR - I 能抑制该耐药细胞系的活力和增殖。流式细胞术表明 ATR - I 对 C4 - 2B - EnzR 细胞具有细胞毒性作用。有趣的是，恩杂鲁胺单独使用对 C4 - 2B - EnzR 细胞没有效果，但与 ATR - I 联合使用时，能显著促进细胞凋亡，这说明 ATR - I 和恩杂鲁胺对恩杂鲁胺耐药细胞具有协同治疗作用。
4. ATR - I 介导 AR/AR - V7 的蛋白酶体降解：AR 信号通路的重新激活和 AR 变异体 AR - V7 的产生促进了 CRPC 的发生和恩杂鲁胺耐药。研究发现，ATR - I 降低了 C4 - 2 和 C4 - 2B - EnzR 细胞系中 AR/AR - V7 及其下游靶基因 TMPRSS2 和 PSA 的蛋白水平。在 C4 - 2 细胞中，ATR - I 处理导致 AR mRNA 表达下降，而在 C4 - 2B - EnzR 细胞中，AR/AR - V7/TMPRSS2 的 mRNA 水平略有上升。通过用环己酰亚胺（CHX）处理细胞实验发现，ATR - I 处理后 AR/AR - V7/TMPRSS2 的半衰期缩短。用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理细胞后，ATR - I 介导的 AR/AR - V7 蛋白下调得以恢复，这表明 ATR - I 诱导了 AR/AR - V7 蛋白的泛素依赖性降解。IP 实验也证明，ATR - I 增强了两种细胞系中 AR/AR - V7 的泛素化程度。此外，ATR - I 处理还损害了 AR 的核转位，导致其核质比显著下降。
5. KIF15 是 ATR - I 的潜在靶基因：RNA 测序分析发现 Kinesin 家族成员 15（KIF15）是 ATR - I 的潜在靶基因。生物信息学分析显示，KIF15 在 PCa 组织中高表达，其表达与 Gleason 评分（GS）、病理 T/N 分期正相关，且高表达的 KIF15 预示着更差的无进展生存期（PFS）和无病生存期（DFS）。免疫印迹和免疫组化染色结果也证实，KIF15 在 PCa 组织和细胞系中过表达。进一步研究发现，长期去势剥夺或恩杂鲁胺治疗会导致 KIF15 表达上调，而沉默 KIF15 则抑制 C4 - 2B - EnzR 细胞的活力，并增加其对恩杂鲁胺的敏感性。同时，ATR - I 能够抑制 KIF15 的 mRNA 和蛋白表达。
6. ATR - I 通过调节 KIF15 表达抑制 AR/AR - V7 的稳定：单样本基因集富集（ssGSEA）分析表明，KIF15 与肿瘤增殖、DNA 复制和 PI3K/Akt/mTOR 通路高度相关。虽然 KIF15 和 AR 的 mRNA 水平呈正相关，但过表达 KIF15 并未改变 AR/AR - V7 的 mRNA 表达。然而，KIF15 过表达延长了 AR/AR - V7 蛋白的半衰期，增加了其表达水平，并抑制了 AR/AR - V7 蛋白的泛素化。过表达 KIF15 部分挽救了 ATR - I 对 AR/AR - V7 表达的抑制作用，一系列生物学实验表明，KIF15 过表达部分恢复了 C4 - 2B - EnzR 和 AR 阴性的 PC - 3 细胞的增殖能力，阻断了 ATR - I 促进细胞凋亡的活性，这说明下调 KIF15 是 ATR - I 发挥肿瘤抑制功能的重要机制。
7. ATR - I 在体内抑制肿瘤生长：为了探究 ATR - I 在体内对 PCa 发展的影响，研究人员构建了小鼠异种移植模型。结果显示，ATR - I 单独处理就能抑制肿瘤生长，与恩杂鲁胺联合使用时，协同抑制肿瘤生长的效果更明显。经过约 1 个月的 ATR - I 处理，皮下肿瘤的体积和重量显著减小，且小鼠体重在各处理组间无明显差异，这表明短期 ATR - I 治疗没有明显的毒副作用。免疫组化染色结果显示，ATR - I 处理后，增殖标记物 Ki67 显著减少，AR/AR - V7 的表达变化与 Ki67 的变化趋势一致。同时，ATR - I 和恩杂鲁胺联合处理显著加剧了肿瘤细胞的凋亡。

综合上述研究，ATR - I 是一种有效的抗难治性 CRPC 的草药药物。它能够抑制 CRPC 细胞的存活和转移，与恩杂鲁胺具有协同抗肿瘤作用。ATR - I 可诱导 AR/AR - V7 的蛋白酶体降解，从而克服恩杂鲁胺耐药，这在一定程度上依赖于其对 KIF15 表达的特异性抑制作用。这些研究结果为 ATR - I 在 CRPC 临床治疗中的应用提供了理论依据，具有重要的临床价值。不过，该研究也存在一些局限性，如未探究 ATR - I 对其他 AR 剪接变体的影响，KIF15 影响 AR/AR - V7 稳定性过程中涉及的酶以及 KIF15 在 AR^- CRPC 中的作用机制等还需进一步研究。但总体而言，这项研究为 CRPC 的治疗开辟了新的方向，有望为众多患者带来新的希望。