追踪植物发育与再生过程中分生组织细胞谱系的一体化 CRE/LOX 系统

为探究植物分生组织的形成及新器官产生机制，研究人员利用一体化 CRE/LOX 系统，揭示了相关细胞谱系，意义重大。

　　在植物的生长发育过程中，根顶端分生组织（Root Apical Meristem，RAM）和茎顶端分生组织（Shoot Apical Meristem，SAM）扮演着至关重要的角色。它们就像植物生长的 “指挥中心”，包含着干细胞及其谱系，是维管植物地下和地上器官形成的核心区域。准确追踪干细胞谱系，对于理解 RAM 和 SAM 的形成过程，以及它们如何产生新器官，有着极其重要的意义。然而，此前虽然已经有一些研究关注植物的发育和再生过程，但仍存在诸多未解决的问题。例如，在组织培养中，虽然知道 SAM 可追溯到外植体中的单个细胞，但并不清楚是单个还是一组茎尖祖细胞负责在诱导培养基（SIM）上形成 SAM；在根的发育过程中，对于在不同环境下，如渗透压胁迫或土壤中，RAM 的干细胞龛（stem cell niche）内的细胞行为变化也了解甚少。

为了深入探究这些问题，来自华东师范大学生命科学学院以及中国科学院上海植物生理生态研究所等单位的研究人员开展了相关研究。他们的研究成果发表在《Plant Methods》上，为植物发育和再生领域带来了新的突破。

研究人员在本次研究中运用了多种关键技术方法。其中，一体化 CRE/LOX 系统是核心技术，该系统将 CRE 和 LOX 整合在一个质粒构建体中，利用不同的启动子驱动，实现对细胞谱系的追踪。同时，结合了 GUS 染色和 RUBY 报告基因技术，通过观察 GUS 信号和 RUBY 介导的红色甜菜色素信号，直观地呈现细胞的分化和谱系关系。研究以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）为实验材料，构建了多种转基因株系进行实验。

下面来详细了解研究结果：

• 一体化 pBI101 - CRE/LOX - GUS 系统：研究人员构建了一体化的 pBI101 - CRE/LOX - GUS 系统，该系统由两部分组成。一部分是融合了地塞米松（DEX）诱导的核定位结构域 GR 序列的 intCRE 基因（带有内含子插入，避免其编码蛋白在细菌中积累），由组织特异性启动子驱动，终止于热休克蛋白 18.2（HSP_18.2）终止子；另一部分是融合片段 LOX2272 - eGFP - NOS - LOX2272，插入在拟南芥泛素 10（UBQ10）启动子和 GUS 报告基因之间，阻断 GUS 表达。当 CRE - GR 蛋白在 DEX 诱导下进入细胞核，会重组两个 LOX2272 序列，激活 GUS 表达，从而标记细胞谱系。研究人员将 WOX5 启动子克隆到该系统中，转化拟南芥。实验结果表明，在侧根和不定根的发育过程中，WOX5 表达被激活，侧根和不定根的所有细胞均为 WOX5 表达的原基细胞的后代，这与先前研究结果一致，证明了该系统的可靠性。
• RAM 在不同培养条件下的细胞谱系：研究人员利用 pBI101 - WOX5^pro - CRE/LOX - GUS 转基因植株，分析了 RAM 在不同培养条件下的细胞谱系。在模拟条件下，GUS 信号仅在静止中心（Quiescent Center，QC）细胞中被观察到，表明 WOX5 标记的 QC 细胞不分裂补充初始 / 干细胞。然而，当植株在含有甘露醇的培养基中生长，受到渗透压胁迫时，除了 QC 细胞，在维管初始细胞、皮层和内皮层初始细胞中也出现了 GUS 信号。在土壤中培养时也观察到类似现象，这表明在渗透压胁迫或土壤生长条件下，WOX5 标记的 QC 细胞可能分裂补充初始 / 干细胞。
• SAM 再生过程中的细胞谱系：在拟南芥下胚轴的两步组织培养过程中，研究人员为了分析 SAM 形成过程中的细胞谱系，建立了两种不同的培养条件。在第一种条件下，将下胚轴在含有 DEX 的愈伤组织诱导培养基（CIM）上培养 5 天 30 分钟，使 CRE 蛋白有足够时间重组几乎所有中间细胞层的 LOX2272 序列，结果在再生的 SAM 中几乎所有细胞都有 GUS 信号；在第二种条件下，先在不含 DEX 的 CIM 上培养 5 天，再用 DEX 处理 30 分钟，CRE 蛋白在部分细胞中重组 LOX2272 序列，导致再生的 SAM 中出现 GUS 信号的镶嵌现象。这一结果表明，SAM 不是由单个茎尖祖细胞形成，而是由一组茎尖祖细胞共同作用形成。
• 一体化 pBI101 - CRE/LOX - RUBY 系统：为了实时、活体追踪细胞谱系，研究人员构建了 pBI101 - CRE/LOX - RUBY 系统，用 RUBY 基因替换 pBI101 - CRE/LOX - GUS 中的 GUS 基因，RUBY 编码的酶可将酪氨酸转化为红色甜菜色素，无需额外染色即可观察。研究人员将 WOX11 启动子克隆到该系统中，转化拟南芥。结果在不定根再生过程中，清晰观察到红色甜菜色素信号，支持了不定根起源于 WOX11 标记的不定根起始细胞的观点。

研究结论和讨论部分进一步深化了研究成果的意义。本研究成功构建并验证了一体化 CRE/LOX 系统，该系统能够基于 GUS 信号或 RUBY 介导的红色甜菜色素信号有效追踪细胞谱系。研究发现，胁迫条件可能影响 RAM 中的细胞谱系或细胞身份，QC 细胞在渗透压胁迫或土壤生长条件下可能分裂补充初始 / 干细胞，这为深入理解 RAM 的发育机制和细胞谱系提供了新的视角。同时，研究确认了 SAM 由一组茎尖祖细胞形成，而非单个细胞，这对于研究植物组织培养中茎尖祖细胞如何协同形成 SAM 的机制具有重要意义，也为后续研究提供了方向。总之，这项研究不仅为植物发育和再生领域提供了强大的研究工具，还揭示了植物分生组织发育和再生过程中细胞谱系的重要信息，为该领域的进一步发展奠定了坚实基础。