柑橘溃疡病菌的两个 TAL 效应蛋白促进病斑形成的机制及抗病育种新策略

为探究柑橘溃疡病菌（Xcc）的致病机制，研究人员对 PthA5 和 PthA6 展开研究，发现其可促进病斑形成，为抗病育种提供依据。

　　柑橘，作为人们日常生活中常见且喜爱的水果，为全球经济贡献着巨大价值。然而，柑橘产业却面临着一个严峻的挑战 —— 柑橘溃疡病（Citrus bacterial canker，CBC）。这一由柑橘黄单胞菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）引发的病害，就像一场可怕的瘟疫，严重威胁着柑橘的产量和品质，给果农们带来了沉重的经济损失。

在过去的研究中，人们已经知道 Xcc 会利用转录激活样效应蛋白（transcription activator-like effector，TALE）PthA4 来靶向柑橘的主要感病基因 CsLOB1，从而帮助病菌入侵柑橘，导致植株感病。但是，除了 PthA4 之外，其他 TALEs 在病菌致病过程中究竟扮演着怎样的角色，却一直是个未解之谜。为了找到答案，来自上海交通大学农业与生物学院等机构的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在了《Molecular Horticulture》上。

研究人员采用了多种技术方法来深入探究这一问题。在基因编辑方面，运用 PTG/Cas9 系统对柑橘 CsGRAS9 基因的启动子进行编辑，获得了一系列突变体。通过生物信息学分析，预测 TALEs 的靶基因以及它们与启动子的结合位点。同时，利用电泳迁移率变动分析（EMSA）、酵母单杂交等实验技术，验证 TALEs 与靶基因启动子的结合能力，还通过定量实时 PCR（qRT-PCR）技术检测基因表达水平的变化 。

研究人员首先对 Xcc003 和 Xcc086 菌株中的 tal 基因进行克隆和测序，发现了两个 PthA1 变体，命名为 PthA5 和 PthA6。通过构建含有 PthA5 和 PthA6 的重组质粒，并将其导入 tal 基因缺失的 Xcc049E 菌株中，研究人员发现，含有 PthA5 和 PthA6 的菌株能够在感病的葡萄柚上引起典型的溃疡病症状，包括细胞增生和肥大，而且细菌生长速度也明显加快。这表明 PthA5 和 PthA6 是 Xcc 的致病因子，在病菌感染柑橘的过程中发挥着重要作用。

为了进一步探究 PthA5 和 PthA6 的作用机制，研究人员利用生物信息学工具预测了它们的靶基因。结果发现，PthA5 和 PthA6 的效应子结合元件（effector-binding elements，EBEs）主要位于 CsGRAS9 基因的启动子区域。EMSA 实验证实，PthA4、PthA5 和 PthA6 都能够与 CsGRAS9 启动子结合，其中 PthA5 的结合活性最强。此外，酵母单杂交和瞬时表达实验也表明，PthA5 和 PthA6 能够直接抑制 CsGRAS9 的转录。

研究人员还对柑橘 GRAS9 启动子的自然变异进行了研究。他们发现，在抗溃疡病的香港金橘中，FhGRAS9 启动子存在一个 558bp 的缺失，这一缺失导致 PthA5 和 PthA6 无法与 FhGRAS9 启动子结合，从而使得 FhGRAS9 的表达不受抑制。相反，在感病的柑橘品种中，CsGRAS9 启动子的 EBE 区域能够与 PthA5 和 PthA6 结合，导致 CsGRAS9 表达被抑制。这表明，GRAS9 启动子的自然变异与柑橘对溃疡病的抗性密切相关。

为了验证 CsGRAS9 在柑橘溃疡病抗性中的作用，研究人员构建了一个靶向 CsGRAS9 启动子的人工 dTALE（dGRAS9）。实验结果显示，表达 dGRAS9 的 Xcc 菌株感染葡萄柚后，细菌生长受到抑制，溃疡病症状减轻，CsGRAS9 的表达水平升高。这说明 CsGRAS9 能够增强柑橘对溃疡病的抗性。

研究人员利用 PTG/Cas9 系统对‘安流’甜橙的 CsGRAS9 启动子进行编辑，获得了多个突变体。这些突变体中，部分在 EBE 区域发生了缺失或插入突变。实验结果表明，这些突变体对 Xcc 的抗性明显增强，CsGRAS9 的表达水平也有所提高。这进一步证实了编辑 CsGRAS9 启动子可以增强柑橘对溃疡病的抗性。

研究人员通过 STRING 数据库预测了与 CsGRAS9 相互作用的蛋白，并通过酵母双杂交实验验证了 CsGRAS9 与 CsTAC1 的相互作用。同时，研究人员还检测了 CsGRAS9 过表达植株中 GA 相关基因的表达水平，发现 CsGRAS9 能够调节 GA 生物合成和代谢相关基因的表达。这表明 CsGRAS9 可能通过调节 CsTAC1 和 GA 相关基因的表达来影响柑橘对溃疡病的抗性。

这项研究首次揭示了 TALEs 作为抗性基因的抑制因子，能够使柑橘宿主感病的分子机制。研究人员发现的 PthA5 和 PthA6 促进溃疡病症状形成的机制，以及 GRAS9 启动子自然变异与柑橘抗性的关系，为柑橘抗病遗传育种提供了重要的理论依据和潜在的遗传资源。同时，研究中运用的 PTG/Cas9 系统为研究 Xcc / 柑橘病理系统提供了有效的工具，为柑橘溃疡病的防治开辟了新的途径。未来，有望基于这些研究成果，培育出更具抗性的柑橘品种，让柑橘产业摆脱溃疡病的困扰，实现可持续发展。