极化分辨二次谐波生成显微镜揭示关节软骨胶原纤维的奥秘

为探究关节软骨病变机制，研究人员用 pSHG 显微镜研究其胶原纤维结构及力学响应，成果助力软骨修复。

　　

关节软骨研究：探寻胶原纤维的奥秘

在人体的关节中，关节软骨扮演着至关重要的角色，它如同精密的缓冲垫，在关节运动时负责承受负荷、吸收冲击，默默守护着下方的软骨下结构。其独特的生物力学性能，源于细胞外基质（ECM）中由胶原蛋白网络与富含蛋白聚糖的间质液构成的复杂体系。胶原蛋白网络在不同区域呈现出深度依赖的纤维组织模式，分为浅层区（SFZ）、过渡区（TZ）和深层区（DZ），这些区域的纤维取向和排列方式各有特点，共同决定了关节软骨在面对外部负荷时的独特反应。

然而，长期以来，科学界对关节软骨的结构 - 力学关系的理解存在诸多空白。一方面，现有的成像技术在研究软骨时存在局限性。例如，磁共振成像（MRI）虽具有非侵入性和软组织对比度高的优点，但分辨率有限；电子显微镜虽能提供高分辨率的图像，却因视野受限和样本制备复杂，难以对整个组织深度的结构响应进行研究。另一方面，关节软骨的退化性疾病，如骨关节炎，严重影响着人们的健康和生活质量。目前，对于这些疾病的发病机制和治疗方法的研究仍面临诸多挑战。因此，深入了解关节软骨的结构与力学性能之间的关系，成为解决这些问题的关键。

为了攻克这些难题，来自英国的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们利用极化分辨二次谐波生成显微镜（pSHG），对关节软骨的胶原纤维超微结构进行了深入探究，并分析了其在不同应变水平下的力学响应。该研究成果发表在《Acta Biomaterialia》上，为关节软骨的研究开辟了新的道路。

研究人员采用牛的软骨 - 骨外植体作为研究对象，这些外植体取自牛的掌指关节，该区域在关节运动中承受主要负荷。在实验过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过定制的加载装置对样本施加不同程度的压缩应变（0%、8% 和 16%），同时利用 pSHG 显微镜进行成像，该显微镜基于 Olympus Fluoview 300 BX51 平台构建，配备了 mode - locked femtosecond Ti:Sapphire 激光，能够实现高分辨率的成像。其次，通过分析不同偏振角度下的 SHG 信号强度，研究人员量化了胶原纤维的主要取向（φ2?）和排列程度（I2?），从而深入了解胶原纤维的分子组织情况。此外，研究人员还运用了双光子激发荧光（TPEF）技术，通过细胞的自发荧光特性确定软骨细胞、潮标和粘合线的解剖标志，为区域标记和分析提供支持。

研究结果

1. 软骨区域微观结构和超微结构特征：通过 pSHG 分析，研究人员发现不同区域的胶原纤维取向和排列程度存在显著差异。在浅层区，胶原纤维几乎平行于软骨表面排列，平均主要取向为 14° ± 8°；过渡区的纤维取向多样，没有明显的峰值；深层区和钙化软骨区的纤维则主要垂直于软骨表面，平均主要取向分别为 83° ± 7° 和 75° ± 10°。在排列程度方面，深层区的下部区域胶原纤维排列最为紧密，过渡区的排列最为松散。
2. 深度依赖的超微结构梯度和区域比例：研究人员通过绘制散点图分析了软骨超微结构特征的空间梯度。发现主要取向的异质性在区域边界处变化显著，如在钙化软骨区和软骨下骨板的界面处，由于骨形态的影响，胶原纤维取向呈现出广泛的角度分布。基于超微结构特征确定的区域比例显示，尽管整体透明软骨厚度在样本间差异较大，但各区域的比例相对稳定，浅层区占总体厚度的 6.93% ± 2.18%，过渡区占 17.33% ± 6.28%，深层区占 75.74% ± 7.88%。
3. 不同区域软骨的力学响应：在压缩应变下，不同区域的软骨表现出不同的力学响应。过渡区在低应变时主要通过纤维重取向来适应变形，随着应变增加，纤维重新排列的作用逐渐增强；深层区的纤维在高应变下发生屈曲，导致排列程度降低和取向异质性增加；浅层区的纤维取向变化较小，但排列程度在低应变时增加，高应变时降低。

研究结论与讨论

这项研究利用 pSHG 技术，成功量化了关节软骨的超微结构及其对加载的响应，为理解关节软骨的生物学和力学性能提供了重要依据。研究发现的胶原纤维超微结构的空间梯度，以及不同区域在压缩应变下的独特响应，有助于深入了解关节软骨的力学功能和退化机制。

例如，过渡区在抵抗压缩时表现出的动态适应机制，即先通过纤维重取向允许较大变形，然后通过纤维排列来限制过度变形，这为解释关节软骨的损伤和退化过程提供了新的视角。同时，研究结果也为治疗干预和组织工程提供了重要的参考，有助于确定治疗靶点，指导软骨修复和再生的研究。

然而，该研究也存在一些局限性。pSHG 显微镜只能捕捉胶原组织的平面内成分，无法全面了解三维网络中的组织和响应；此外，研究在捕捉细胞周基质和处理样本表面损伤方面也存在挑战。未来的研究需要进一步解决这些问题，以更深入地了解关节软骨的结构和功能。

总的来说，这项研究为关节软骨的研究提供了重要的基础数据，其成果对于推动关节软骨相关疾病的治疗和组织工程的发展具有重要意义，有望为改善人们的关节健康带来新的突破。