基于 Orbitrap Astral 质谱仪的血浆 N - 糖蛋白质组深度剖析：开启精准医学新视野

为解决血浆糖蛋白质组分析难题，研究人员开展 nGlycoDIA 策略研究，实现深度分析，助力临床研究。

　　

血浆 N - 糖蛋白质组研究：突破困境，探索生命奥秘

在生命科学的微观世界里，蛋白质糖基化是血浆蛋白中极为常见且意义重大的一种共 / 翻译后修饰（PTM）。它就像给蛋白质穿上了不同的 “糖衣”，这些 “糖衣” 不仅在蛋白质的受体相互作用、免疫反应、定位等生物特性方面发挥着关键作用，还影响着蛋白质的溶解度、结构和稳定性等物理性质。而且，“糖衣” 的组成和结构会因饮食、疾病、衰老等外部因素而发生显著变化，这使得血浆糖蛋白质组成为潜在生物标志物的 “富矿”。

然而，当前的血浆糖蛋白质组研究面临着诸多挑战。一方面，糖肽的信号会因聚糖微异质性而稀释，其电离效率相对较低，并且需要复杂的碎片化方法来获取聚糖和肽序列信息；另一方面，血浆中蛋白质的动态范围极宽，这进一步增加了研究的难度。为了攻克这些难题，来自荷兰乌得勒支大学（Utrecht University）和德国赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究方法：创新技术，精准剖析

研究人员采用了一系列先进技术来实现对血浆 N - 糖蛋白质组的深度分析。首先，他们利用棉基亲水相互作用色谱（cotton-HILIC SPE）对血浆样本进行糖肽富集，有效提高了糖肽的浓度。然后，借助 Thermo Scientific? Orbitrap? Astral?质谱仪，结合窄窗口数据非依赖采集（nDIA）策略，开发了专门的 nGlycoDIA 工作流程。在数据处理方面，运用 Byonic 软件进行分析，并与其他软件如 MSFragger、diaTracer 和 DIA-NN 等进行对比验证，确保结果的准确性和可靠性。

研究结果：深度挖掘，成果丰硕

1. 建立 nGlycoDIA 方法：研究人员通过优化实验参数，如前体 m/z 范围、隔离窗口大小、最大离子注入时间和碰撞能量等，成功建立了 nGlycoDIA 方法。他们发现，选择 m/z 955 - 1655 的前体范围和 3 Th 的隔离窗口，能有效提高糖肽的鉴定数量，减少非糖基化肽的干扰，同时保证数据的可靠性和可重复性。
2. 深度覆盖低丰度血浆蛋白：使用优化后的 nGlycoDIA 方法，研究人员在 40 分钟内从糖肽富集的血浆样本中累计鉴定出超过 3000 个独特的糖肽 PSM（glycoPSMs），这些糖肽来自 181 种糖蛋白，动态范围涵盖 7 个数量级。在未富集的粗血浆样本中，也能检测到一定数量的糖肽，且 20 分钟的梯度分析足以实现最大检测量。此外，研究还发现，nGlycoDIA 方法能够鉴定出多种低丰度的糖蛋白，包括因子 VIII 和表皮生长因子受体等，为深入了解血浆蛋白的功能提供了重要依据。
3. 检测糖基化低丰度细胞因子：研究人员在血浆中检测到了多种糖基化的细胞因子和生长因子，如白细胞介素 IL-12A、IL-12B、IL-22，集落刺激因子 CSF1、CSF2，以及血管活性肠肽（VIP）等。这些细胞因子在炎症和癌症等疾病中发挥着重要作用，此前其在人血浆中的糖基化实验证据尚未见报道。研究人员对这些细胞因子的糖基化特征进行了详细分析，并通过结构建模探讨了糖基化对其功能的影响，为进一步理解疾病机制提供了新的视角。
4. 实现高通量高灵敏度血浆糖蛋白质组学：研究表明，缩短梯度时间至 10 分钟仍能检测到近 1850 个独特的 glycoPSMs（95% CI [1840 - 1860]），这表明 nGlycoDIA 方法有望实现高通量的临床血浆糖蛋白质组分析。同时，研究人员还对不同梯度时间下的蛋白质和糖基化位点进行了分析，发现随着梯度时间的缩短，虽然鉴定的糖肽数量有所减少，但在 10 分钟梯度下仍具有较高的效率。此外，研究还评估了不同数据分析软件对 nGlycoDIA 数据的适用性，结果表明 Byonic 软件在鉴定糖肽方面表现最佳。

研究结论与意义：开拓视野，引领未来

这项研究成功评估了 Orbitrap Astral 质谱仪在血浆糖蛋白质组分析中的潜力，通过 nGlycoDIA 方法实现了对血浆糖蛋白质组的深度分析。研究成果不仅提高了对血浆糖蛋白质组的认识，还为临床研究和疾病诊断提供了重要的参考。例如，检测到的低丰度糖基化细胞因子可能成为潜在的疾病生物标志物，有助于深入了解疾病的发生发展机制。此外，nGlycoDIA 方法的高通量特性为大规模临床样本的分析提供了可能，有望推动精准医学的发展。

然而，研究也存在一些局限性。例如，目前的数据分析软件在处理糖蛋白质组数据时仍存在一定的局限性，需要进一步改进；研究主要侧重于定性分析，对糖肽的定量分析还有待加强。未来的研究可以针对这些问题进行深入探索，进一步完善血浆糖蛋白质组的研究方法，为生命科学和健康医学领域带来更多的突破。