HC-Pro 抑制 HEN1 甲基转移酶活性，引发 AGO1 自噬性降解的机制解析

为探究不同马铃薯 Y 病毒（potyvirus）的 HC-Pro 对 RNA 沉默的抑制作用，研究人员开展相关研究，发现 P1/HC-ProTu抑制 HEN1 活性最强，且与 AGO1 自噬降解相关，为深入理解 RNA 沉默调控机制提供新视角。

　　在植物的微观世界里，病毒与植物的对抗时刻都在上演。RNA 沉默是植物抵御病毒入侵的重要防线，而马铃薯 Y 病毒（potyvirus）编码的辅助成分蛋白酶（Helper-component proteinase，HC-Pro）作为病毒抑制 RNA 沉默（VSRs）的 “利器”，却让这场防御战变得复杂起来。尽管 HC-Pro 在不同病毒中都有抑制 RNA 沉默的功能，但它们之间仅约 40% 的相似性，暗示着其抑制能力可能存在差异，尤其是在抑制 HEN1 甲基转移酶活性方面。此前研究虽揭示了 HC-Pro 的部分作用，但仍有诸多谜团未解开，比如不同 HC-Pro 抑制 HEN1 的能力究竟有何不同？它们对 RNA 沉默通路的影响机制又是怎样的？这些问题如同迷雾，笼罩着科研人员对植物与病毒相互作用的探索之路。

为了驱散这些迷雾，来自国立台湾大学（National Taiwan University）的研究人员展开了深入研究。他们通过一系列实验，揭开了 HC-Pro 抑制 RNA 沉默的神秘面纱，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在研究过程中，利用免疫共沉淀技术（IP）来研究蛋白质之间的相互作用；通过大小排阻色谱法（SEC）分析细胞中不同成分的分布；借助转录组分析探究基因表达的变化情况；运用荧光共振能量转移（FRET）技术检测蛋白质之间的物理相互作用；使用蛋白质免疫印迹（western blotting）和液相色谱 - 质谱联用技术（LC-MS/MS）对蛋白质进行定量分析；利用透射电子显微镜（TEM）观察细胞结构和蛋白质定位。

研究结果如下：

• 不同 P1/HC-Pro 变体与 RNA 沉默抑制相关的分子特征：研究人员利用不同物种或修饰的 P1/HC-Pro 基因进行实验，发现表达不同 P1/HC-Pro 的转基因植物中，miR159、miR168 和 miR168 * 积累水平异常，且 P1/HC-Pro 会阻碍 miRNA 双链加载到 RNA 诱导沉默复合体（RISC）中，使其以游离形式积累。同时，不同 P1/HC-Pro 植物对 RNA 沉默的抑制能力存在差异，P1/HC-Pro^Tu抑制 RNA 沉默的能力独特。此外，不同 HC-Pro 在植物细胞中的定位和形成的结构也有所不同，具有各自的特点。
• HC-Pro^Tu增强 AGO1 降解并招募 AGO1 至 H 体：研究发现，不同 P1/HC-Pro 变体对 AGO1 表达水平的调控不同，P1/HC-Pro^Tu和 P1/HC-Pro^2y植物中 AGO1 水平显著降低。虽然部分 P1/HC-Pro 植物中 AGO1 蛋白水平下降，但 AGO1 mRNA 水平却有所增加。细胞生物学实验表明，HC-Pro^Tu能间接吸引 AGO1 至 H 体，可能触发 AGO1 降解，而 HC-Pro^Tuk则不能。
• HC-Pro^Tu触发 AGO1 自噬性降解并与 ATG8a 相互作用：已有研究表明 AGO1 可通过自噬降解，本研究发现 P1/HC-Pro^Tu植物中一些自噬基因显著上调。通过基因编辑技术获得 ATG8a 敲除突变体，发现其 AGO1 水平恢复，表明 ATG8a 参与了 P1/HC-Pro^Tu触发的 AGO1 降解过程。免疫电镜观察发现，在 P1/HC-Pro^Tu植物的叶细胞中存在自噬泡（Av）/ 自噬相关（Ap）结构，且 HC-Pro^Tu、AGO1 和 ATG8a 均存在于这些结构中，同时 HC-Pro^Tu与 YFP-ATG8a 存在直接相互作用，促进 YFP-ATG8a 招募至 H 体。
• 不同 HC-Pro 变体抑制 HEN1 活性的能力不同：分析 β- 消除处理后的 miRNA 发现，P1/HC-Pro^Tu植物中未甲基化的 miRNA（unMet-miRNA）含量最高，表明其抑制 HEN1 介导的 miRNA 甲基化能力最强，而 P1/HC-Pro^2y和 P1/HC-Pro^Te植物抑制能力较弱。体外实验也证实了 HC-Pro^Tu能直接抑制 HEN1 活性，且与 HEN1 存在物理相互作用。
• P1/HC-Pro^Tu植物中未检测到 unMet-miRNA 与 AGO1 结合：研究发现，P1/HC-Pro^Tu植物的 AGO1 免疫沉淀（AGO1-IP）样本中未检测到 unMet-miR159，而在 hen1-8/heso1-1 突变体及 P1/HC-Pro^Tu/hen1-8/heso1-1 植物中，AGO1 可与 unMet-miRNA 结合，且这些 AGO1 复合物具有 RISC 活性，能有效切割底物。

研究结论和讨论部分指出，不同马铃薯 Y 病毒的 HC-Pro 变体对 HEN1 活性的抑制存在差异，HC-Pro^Tu抑制能力最强。HC-Pro^Tu和 HC-Pro^2y与 HEN1 有结合亲和力，但不直接结合 miRNA 双链。H 体可能限制 HEN1 和 AGO1 的活性，且可能与过氧化物酶体相关。HESO1 在 RNA 沉默抑制中可能发挥重要作用，HC-Pro 介导的 unMet-miRNA 积累与 AGO1 自噬性降解相关，不同 P1/HC-Pro 导致的游离形式 miRNA 积累可能影响 RISC 形成。此外，研究还观察到 AGO1 的不同亚型，其 N 端区域对功能和稳定性具有重要意义。

这项研究揭示了 HC-Pro 抑制 RNA 沉默的复杂机制，为理解植物与病毒相互作用提供了重要依据，也为进一步研究 RNA 沉默调控、开发植物抗病毒策略开辟了新方向，在植物病毒学和农业生产领域具有重要的理论和实践意义。