大豆苷元或成皮肤纤维化治疗新希望

为探究大豆苷元（Dai）对皮肤纤维化的作用，研究发现其可抑制 TGF-β1信号通路，或成潜在治疗药物。

　　皮肤纤维化是一种令人困扰的疾病，其中瘢痕疙瘩最为典型。瘢痕疙瘩表现为皮肤成纤维细胞的细胞外基质过度沉积、异常增殖、侵袭和迁移，不仅影响美观，还常伴有瘙痒、疼痛，严重时限制关节活动，极大地降低了患者的生活质量。目前，皮肤纤维化的发病机制尚不明确，现有的治疗方法，如手术切除和病灶内注射类固醇，预后效果不佳，复发率高，这使得寻找一种有效的治疗药物成为医学领域的迫切需求。

为了解决这一难题，南开大学的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦于大豆苷元（Daidzein，Dai），这是一种存在于大豆食品中的异黄酮化合物，前期研究发现其在心血管疾病、心脏纤维化和肺纤维化等方面具有积极作用，但在皮肤纤维化领域的研究尚少。此次研究成果发表在《Scientific Reports》上，为皮肤纤维化的治疗带来了新的希望。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，通过分离和培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）和小鼠原代真皮成纤维细胞（DFs），利用 CCK-8、EdU 掺入、划痕愈合、Transwell 等实验检测细胞增殖和迁移能力；采用定量实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）分析相关基因和蛋白表达水平；运用免疫荧光染色直观观察细胞内蛋白的表达和定位。在动物实验中，建立了博来霉素（BLM）诱导的皮肤纤维化小鼠模型和瘢痕疙瘩异种移植小鼠模型，通过组织学检查、羟脯氨酸含量测定、免疫组织化学染色等方法评估皮肤纤维化程度。此外，还运用了药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验、分子对接、细胞热迁移实验（CETSA）等技术探究大豆苷元的作用靶点和机制。

研究结果如下：

• Dai 抑制 TGF-β₁诱导的小鼠原代皮肤成纤维细胞增殖和迁移：CCK-8 实验确定了 Dai 对 DFs 的半数抑制浓度（IC₅₀），在此基础上选择合适浓度进行后续实验。结果显示，Dai 能剂量依赖性地抑制 TGF-β₁诱导的 DFs 增殖，通过 EdU 实验和 CCK-8 实验得以验证；同时，划痕愈合实验和 Transwell 分析表明 Dai 显著抑制细胞迁移，并且 Dai 还抑制了基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制剂的比例。
• Dai 抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和迁移：CCK-8 实验测定了 Dai 对 KFs 的 IC₅₀，后续实验发现 Dai 在 9 天内剂量依赖性地抑制 KFs 增殖，EdU 实验进一步证实了这一结果；Dai 还能显著抑制 KFs 迁移，体外瘢痕疙瘩组织块培养模型也得出了相似结论，并且 Dai 同样抑制了 KFs 中基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制剂的比例。
• Dai 通过 TGF-β-Smad2/3 信号通路阻止小鼠原代真皮成纤维细胞激活：Dai 剂量依赖性地降低 TGF-β₁诱导的 α-SMA、I 型胶原蛋白（Col-1α）和纤连蛋白（Fn）在 mRNA 和蛋白质水平的表达；机制研究发现，Dai 降低了 TGF-β₁诱导的 Smad2 和 Smad3 的磷酸化水平，免疫荧光分析也证实了这一结果。
• Dai 通过 TGF-β-Smad2/3 信号通路减少瘢痕疙瘩成纤维细胞激活：与上述实验结果相似，Dai 剂量依赖性地降低 KFs 中 α-SMA、Col-1α 和 Fn 在 mRNA 和蛋白质水平的表达，降低 Smad2 和 Smad3 的磷酸化水平，免疫荧光分析进一步证明了 Dai 对 KFs 激活的抑制作用。
• Dai 改善 BLM 诱导的皮肤纤维化：在 BLM 诱导的皮肤纤维化小鼠模型中，Dai 减少了真皮厚度和胶原蛋白刺激，降低了羟脯氨酸含量，抑制了 α-SMA、Col-1α、Fn、MMP-1/TIMP-1、MMP-2/TIMP-1 和 MMP-13/TIMP-1 在 mRNA 和蛋白质水平的表达，并且降低了磷酸化 Smad2 和 Smad3 的水平，免疫组织化学分析也得到了相同结果。
• Dai 改善异种移植瘢痕疙瘩组织的纤维化激活：在瘢痕疙瘩异种移植小鼠模型中，Dai 减轻了组织重量，抑制了胶原蛋白沉积，抑制了 α-SMA、Col-1α、Fn、MMP-1/TIMP-1、MMP-2/TIMP-1 和 MMP-13/TIMP-1 在 mRNA 和蛋白质水平的表达，免疫组织化学分析也显示出 Dai 对瘢痕疙瘩组织纤维化激活的抑制作用。
• Dai 结合 PKM2 抑制小鼠原代真皮成纤维细胞激活：通过 DARTS 和凝胶内消化实验结合质谱分析，确定丙酮酸激酶 M2（PKM2）是 Dai 的潜在靶点；分子对接显示 Dai 与 PKM2 有较好的结合能力，存在疏水和氢键相互作用；免疫组织化学结果表明 BLM 诱导后 PKM2 表达增加；CETSA 实验证明 Dai 可保护 PKM2 免受降解；沉默 PKM2 后，Dai 对纤维化蛋白的抑制作用与单独使用 Dai 时无明显差异，且 Dai 能降低瘢痕疙瘩异种移植模型中 PKM2 的蛋白水平。

研究结论表明，大豆苷元（Dai）可能通过靶向 PKM2 抑制 TGF-β₁信号通路，从而抑制皮肤纤维化，在小鼠模型和瘢痕疙瘩异种移植中均展现出良好的效果，这为皮肤纤维化的治疗提供了更多的药物选择。在讨论部分，研究人员指出虽然瘢痕疙瘩的治疗仍面临挑战，但此次研究发现了 Dai 对皮肤纤维化的潜在作用，并且明确了其作用机制与 PKM2 和 TGF-β/Smad 信号通路相关。不过，对于 Dai 与 PKM2 的具体结合位点以及 Dai 是否与其他皮肤纤维化相关蛋白结合等问题，还需要进一步研究。同时，研究中使用的裸鼠瘢痕疙瘩异种移植模型存在一定局限性，未来可尝试使用 PDX 模型进一步评估 Dai 的疗效。总体而言，这项研究为皮肤纤维化的治疗开辟了新的方向，具有重要的理论和临床意义，有望为广大皮肤纤维化患者带来更有效的治疗方案。