遗传变异影响多能干细胞 DNA 甲基化稳定性，助力解锁细胞治疗新密码

本文揭示遗传变异影响小鼠多能干细胞（nPSCs）DNA 甲基化稳定性，或可用于筛选稳定细胞系。

　　

研究背景

多能干细胞（nPSCs）拥有强大的自我更新、基因组编辑及分化能力，理论上是再生医学的理想之选。然而，nPSCs 在体外培养时存在严重的表观遗传不稳定性，尤其是 DNA 甲基化异常，这就像给细胞的 “命运蓝图” 添上了错误的笔触，会干扰正常的转录程序和细胞功能，极大地阻碍了其在生物医学领域的应用。

在 nPSCs 培养过程中，DNA 甲基化异常表现多样，既有过度甲基化（hypermethylation），也有甲基化不足（hypomethylation），这些变化会波及关键发育调控基因。特别是印记基因，其 DNA 甲基化的亲代来源不对称性一旦丧失，就难以恢复，还会与胚胎发育缺陷挂钩，让疾病建模变得更加复杂。而且，即使在相同培养条件下，不同 nPSCs 系间的 DNA 甲基化也存在很大差异，以往研究表明，遗传变异会影响 nPSCs 的自我更新、分化等特性，那么它是否也在 DNA 甲基化稳定性上扮演重要角色呢？这成为了本文探索的关键问题。

实验设计

为了揭开遗传变异与 nPSCs DNA 甲基化稳定性之间的神秘关系，研究人员巧妙地选取了不同的实验材料，采用多种技术方法开展研究。

研究人员选用了 7 种近交系小鼠品系的胚胎成纤维细胞（MEFs），利用 OCT4、KLF4、SOX2 和 MYC（OKSM）重编程技术，将其诱导为诱导多能干细胞（iPSCs）。在这个过程中，通过调整培养基成分，如添加抗坏血酸（AA）或长期培养于标准含血清培养基，来观察不同品系 iPSCs 对 DNA 甲基化变化的敏感性。同时，选取 129 和 B6J 品系的胚胎干细胞（ESCs），用 AA 或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂 PD0325901（iMEK）处理，对比不同品系 ESCs 对 DNA 低甲基化的易感性差异。

此外，研究人员利用体外受精（IVF）技术，从遗传多样性丰富的远交系（DO）小鼠建立了大量 ESC 系。这些 DO 小鼠源自 8 个奠基品系，携带超 4000 万个单核苷酸多态性（SNPs）和结构变异，为精准定位调控 DNA 甲基化的遗传位点提供了理想材料。研究人员对 DO ESC 系进行 DNA 甲基化分析，并通过全基因组关联分析（GWAS）定位数量性状位点（QTLs），挖掘潜在的调控基因。

实验结果

近交系小鼠 iPSCs 印记异常的品系特异性

在近交系小鼠 iPSCs 诱导实验中，研究人员成功从 7 种近交系小鼠的 MEFs 诱导出 iPSCs，尽管不同品系的诱导效率有所不同，但都获得了稳定的 iPSC 集落，且这些 iPSC 呈现出典型的多能干细胞形态，并表达多能性相关标记 SSEA1 和 EpCAM。

针对印记基因调控状态，研究人员对 P15 代 iPSCs 的基因组 DNA 进行靶向亚硫酸氢盐测序，聚焦于 3 个父系印记位点（Dlk1 - Dio3、H19/Igf2 和 Rasgrf1）和 12 个母系印记位点（Gnas、Grb10 等）的控制区域。无监督聚类分析发现，DNA 甲基化水平在不同位点和品系间差异显著，但同一遗传背景的独立细胞系聚类在一起，这表明遗传背景对印记稳定性影响重大。

进一步分析发现，B6J - iPSCs 中 Dlk1 - Dio3 位点出现高甲基化，而 129、DBA、CBA 和 C3H 品系的 iPSCs 存在多个位点的低甲基化。在 iPSC 诱导早期，P3 代 129 iPSCs 就出现明显的 DNA 低甲基化，B6J iPSCs 则在后期长期培养时才出现高甲基化，这清晰地展现出品系特异性的 DNA 甲基化变化差异。

遗传背景决定 MAPK 抑制下 DNA 低甲基化的易感性

为了探究其他标准培养方法获得的 nPSCs 是否也存在类似现象，研究人员用 AA 或 iMEK 处理 129 和 B6J 品系的 ESCs 16 天。结果显示，129 ESCs 在 AA 处理下出现一定程度的 DNA 低甲基化，iMEK 处理后所有研究位点的 ICR 甲基化显著降低，与 P3 代 iPSCs 情况相似。相比之下，B6J ESCs 在 AA 或 iMEK 处理后，ICR 甲基化仅适度下降，仍处于生理范围，对病理性 DNA 低甲基化表现出惊人的抗性。

薄层色谱实验表明，iMEK 处理后，129 mESCs 的全基因组 DNA 甲基化水平显著降低，B6J mESCs 则无明显变化，而且两种品系 ESCs 在 iMEK 处理下，ERK 磷酸化和 DNMT3A 水平变化相似，这说明品系间 DNA 甲基化稳定性差异并非源于抑制剂效果不同，而是遗传变异影响了 DNA 甲基转移酶的招募或活性。

遗传多样性远交系小鼠 nPSCs 的 DNA 低甲基化差异

研究人员从 DO 小鼠建立了 85 个雄性 ESC 系，用 iMEK 培养 2 - 4 代后，采用酶促甲基（EM） - seq 和定制靶向捕获面板检测 DNA 甲基化水平。结果发现，DO nPSC 系间的 DNA 甲基化水平差异巨大，ICRs 虽然平均甲基化水平较高，但不同细胞系间的差异也很明显，从部分细胞系的生理水平（约 50%）到其他细胞系的几乎完全去甲基化都有。

主成分分析显示，大多数 ICRs 对 MAPK 抑制的反应高度相关，但少数位点如控制父系印记基因簇的区域、Zdbf2 位点的体细胞 DMR 以及 Trappc9 位点存在差异，这表明多数 ICRs 在 iMEK 处理下会发生病理性 DNA 低甲基化，且遗传变异对其易感性的调节方式相似，但部分位点存在独特的调控机制。

定位调控 DNA 低甲基化的 QTLs

研究人员对 73 个通过质量控制的 DO nPSC 系进行 QTL 定位分析，成功鉴定出 6 个与至少一个 ICR 显著相关的 QTLs，且这些 QTLs 均位于与目标 ICR 不同的染色体上，属于反式作用。其中，位于 Chr4 和 Chr17 的 QTLs 与多个 ICRs 相关，Chr4 QTL 区域包含大量编码 KRAB 锌指蛋白（KRAB - ZFPs）的基因，该区域此前就被发现与 DNA 甲基化调控有关；Chr17 QTL 区域则包含多个可能参与 DNA 甲基化调控的候选基因，如编码 KRAB - ZFPs 的基因、转录共激活因子 Brd4 以及与组蛋白甲基转移酶相互作用的 Wiz。

等位基因效应分析表明，不同 DO 奠基品系的单倍型在 Chr4 和 Chr17 QTL 区域对 DNA 甲基化的影响不同，B6J 和 129 在 Chr17 QTL 区域的作用相反。进一步研究发现，B6J mESCs 中 Wiz 表达水平更高，Chr17^B6J/B6J的 F2 mESCs 比 Chr17^129/129的 F2 mESCs 表达更高水平的 Wiz mRNA，且前者 H3K9me2 水平也更高，不过这种差异在近交系 B6J mESCs 中不显著。此外，Wiz 基因座存在 B6J 特异性结构变异，可能影响其表达，但具体机制还需进一步探究。

研究讨论

本文研究表明，遗传背景在 nPSCs 建立和维持过程中，对 MAPK 信号抑制下游的异常 DNA 低甲基化易感性有重要影响。基于 QTL 定位结果，研究人员推测调控特定反式作用因子（如 KRAB - ZFPs 和 WIZ 等）活性的遗传变异，是导致 nPSCs 表观遗传不稳定的关键因素。

遗传变异对培养的多能干细胞印记稳定性的影响意义深远。在实际应用中，不同细胞系和位点对 DNA 甲基化变化的易感性差异，使得寻找通用的稳定印记培养基变得困难；但从另一个角度看，根据 nPSC 系的遗传变异预测印记稳定性成为可能，还能通过靶向改造特定变异来稳定原本表观遗传不稳定的 PSCs。从基础研究层面，系统鉴定和表征影响 nPSCs 印记稳定性的变异，有助于深入理解 DNA 甲基化稳定性的复杂调控网络，为众多生理和病理过程研究提供关键线索。

研究局限性

本研究也存在一定的局限性。由于样本量相对较小（n = 73 个 DO 系），研究人员只能识别出效应量较大的 QTLs。而且，研究采用的是针对预定义基因组区域的靶向捕获面板，无法全面绘制影响 DNA 甲基化变异的 QTLs 图谱。若对更多 DO nPSC 系进行全基因组 DNA 甲基化分析，有望发现更多 QTLs，进一步明确遗传变异与 nPSCs DNA 甲基化稳定性的关系。此外，研究使用 C57BL/6 参考基因组进行探针设计和读数映射，可能导致 DO 品系中高度差异的单倍型区域定量不准确，但目前评估认为该问题未影响本研究的 QTL 定位结果。

总的来说，这项研究为理解多能干细胞 DNA 甲基化稳定性的遗传调控机制提供了重要依据，为未来优化多能干细胞培养体系、筛选稳定细胞系以及深入探究相关生理病理过程奠定了坚实基础，开启了细胞治疗领域的新篇章。