工程化 DPP4 诱饵：对抗中东呼吸综合征冠状病毒的新希望

本文通过定向进化工程化改造二肽基肽酶 4（DPP4），开发出的诱饵蛋白对中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）及相关病毒有效。

　　

中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的威胁

中东呼吸综合征（MERS）是由 MERS-CoV 引起的病毒性疾病，2012 年在沙特阿拉伯首次被发现。截至 2024 年 1 月，全球 27 个国家已确认 2609 例 MERS-CoV 感染病例，其中 939 人死亡，死亡率达 35.9%。MERS-CoV 源于蝙蝠，通过单峰骆驼传播给人类，还能在人与人之间传播。它与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和 SARS-CoV-2 不同，利用二肽基肽酶 4（DPP4）作为进入细胞的受体，引发下呼吸道疾病。2024 年 4 月，沙特阿拉伯仍有 MERS 病例报告，此外，蝙蝠和穿山甲中发现的类似 MERS-CoV 的病毒，也增加了未来大流行的风险。

目前，针对 MERS-CoV 的治疗药物尚未获批。虽然有一些药物显示出抗病毒活性，如核苷酸类似物瑞德西韦（remdesivir）、蛋白酶抑制剂奈玛特韦（nirmatrelvir）和洛匹那韦（lopinavir）、广谱抗病毒药物利巴韦林和干扰素等，但都没有经过专门开发用于治疗 MERS。在对抗病毒的策略中，抑制病毒刺突蛋白与宿主细胞受体的结合是一种重要方法，单克隆抗体是其中的代表。然而，病毒的高突变率导致新变种出现，使单克隆抗体的疗效短暂，例如奥密克戎（Omicron）变种和 BA.2.86 变种能逃避大多数已批准的单克隆抗体。因此，开发新的方法来克服病毒逃逸至关重要。

工程化 DPP4 诱饵的开发

基于受体诱饵可以克服病毒逃逸的原理，研究人员开发了一种工程化 DPP4 诱饵，旨在控制未来 MERS-CoV 的爆发或类似 MERS-CoV 的大流行。通过定向进化技术，提高 DPP4 与 MERS-CoV 刺突蛋白受体结合域（RBD）的结合亲和力。

研究人员构建了 DPP4 突变体文库，在 293T 细胞中表达后，与重组超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）融合的 RBD 孵育。通过易错 PCR 在 DPP4 与 RBD 的结合界面区域（P264 - T350）引入随机突变，突变率约为每 1kb 10 个突变。将突变后的 PCR 片段插入带有 HA 标签的 DPP4 质粒的沉默限制酶位点，构建约 1×10⁶个突变体的质粒文库。稀释转染该文库到 293T 细胞，确保每个细胞最多表达一种突变体 DPP4。用流式细胞术筛选出结合 RBD - sfGFP 能力最强的 0.05% 的细胞，提取 mRNA 进行下一轮筛选，共进行了四轮随机诱变筛选。

经过筛选，发现一些突变体的结合能力增强。例如，三个可溶性突变体与野生型 DPP4 相比，对 RBD - sfGFP 与细胞结合的竞争活性更高。将高亲和力的可溶性 DPP4 突变体与人类 IgG1 Fc 融合后，其对 MERS-CoV 假病毒的中和效力比野生型提高了 500 多倍。

高亲和力 DPP4 突变体的筛选与特性分析

对第四轮筛选后收获细胞的 mRNA 进行深度测序，发现突变集中在 S277、N281、T283、S284、Q286、T288、A342 和 M348 等位点。其中，N281、T283、Q286 和 T288 被认为是增强亲和力的有希望的候选位点。通过对不同克隆突变体的分析，确定了关键突变。如克隆 21 中的 Q286H 和 T288P 突变，克隆 34 中的 N281Y、S284T 和 T288P 突变，克隆 38 中的 Q286H 突变等对抑制 RBD 与野生型 DPP4 结合至关重要。

对关键突变体的特性进行评估，发现克隆 21v2 和 38v2 等突变体的中和活性比野生型提高了 500 多倍，与单克隆抗体相当。热变性实验表明，这些突变体与野生型 DPP4 相比，结构稳定性没有降低，其解链温度（Tm）值达到 72.0°C，高于之前鉴定的高亲和力 ACE2 突变体的 44.5°C，在蛋白质生物制剂开发方面具有优势。表面等离子共振（SPR）分析显示，突变体的解离常数（K_D）值比野生型降低了约 30 倍，证实了中和活性的提高是由于结合亲和力的增强。此外，克隆 21v2 和 38v2 的诱饵蛋白产量与野生型 DPP4 相比没有明显下降。

综合考虑，由于 N281Y 突变可能对降低 Q286H 和 T288A 疗效的病毒突变体有效，选择克隆 38v2 作为针对多种 MERS 变种的药物候选物。

灭活 DPP4 肽酶活性以避免潜在不良反应

DPP4 是一种广泛表达的糖蛋白，参与多种生理过程，如催化降解肠促胰岛素（包括胰高血糖素样肽 - 1（GLP - 1）和胃抑制肽（GIP）），还可能切割细胞因子（如粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM - CSF）、粒细胞集落刺激因子（G - CSF）、白细胞介素 - 3（IL - 3）和促红细胞生成素）。因此，使用具有催化活性的 DPP4 可能会影响葡萄糖代谢、免疫系统和炎症反应。

研究人员对 DPP4 催化区域的催化三联体（S630、D708 和 H740）以及一些可能关闭底物结合口袋的突变（如 F240C/D737C 和 Y241C/D737C）进行评估。结果发现，虽然这些突变都能完全消除催化活性，但只有 S630A 突变能保持热稳定性，其他突变会降低稳定性或导致无法测量 Tm 值。S630A 和 H740Q 突变能维持蛋白质产量，而其他突变会减少正确折叠蛋白的产生。

基于这些结果，选择 S630A 突变用于构建肽酶失活的 DPP4 诱饵，将带有 S630A 突变的克隆 38v2 定义为 38v3。对 38v3 在小鼠中的安全性评估显示，其对可能的 DPP4 靶点 G - CSF 及其下游的 IL - 6 浓度没有显著影响，表明 38v3 没有明显的不良反应风险。38v3 诱饵的 K_D值为 2.65nM，比克隆 38 和 38v2 略有改善，其中和活性与 38v2 相当，并且对真实的 MERS-CoV 在表达 DPP4 的 293T 细胞中具有显著的中和作用，即使在比野生型诱饵低 100 倍的浓度下也有效。

工程化 DPP4 诱饵抑制逃逸突变的优势

抗病毒治疗面临的挑战之一是病毒可能产生耐药性。在 SARS-CoV-2 感染治疗中，多次使用治疗性抗体的患者出现了逃逸突变。在真实的 MERS-CoV 培养中评估逃逸突变的发生率，用亚最佳浓度的药物处理病毒。在初始传代时，将 0.1 感染复数（MOI）的病毒在系列稀释的 Fc - DPP4（38v3）或重组 3B11 抗体存在下培养，从部分中和的孔中收集扩增的病毒进行后续传代。

结果发现，用单克隆抗体 3B11 处理的病毒池在传代 5 次后，对相同抗体的最高浓度变得不敏感，尽管 3B11 不会诱导完全的逃逸突变，但这也表明单克隆抗体难以克服逃逸突变。而 Fc - DPP4（38v3）在传代 10 次后，对病毒池的中和能力仍然很高，表明没有出现逃逸突变。

工程化 DPP4 对 MERS-CoV 变种和类似 MERS-CoV 的广泛中和作用

研究人员研究了工程化 DPP4（Fc - DPP4（38v3））对 MERS-CoV 变种和利用 DPP4 的 merbecoviruses 的交叉中和广度。从 NCBI 数据库中提取 595 个 MERS-CoV 变种的序列，关注高流行突变以及英格兰 1 型和韩国变种。

结果显示，工程化 DPP4 诱饵对这些突变的中和活性没有明显降低，而 3B11 抗体对韩国变种（D510G 或 I529T）失去了效力。对于能有效感染表达人 DPP4 细胞的代表性 merbecoviruses，如 Tylonycteris 蝙蝠冠状病毒 HKU4、蝙蝠冠状病毒 / Ii/GD/2014 - 422、MjHKU4r-CoV 和穿山甲冠状病毒 HKU4 - P251T，工程化 DPP4 抑制了 MjHKU4r-CoV 和穿山甲冠状病毒 HKU4 - P251T 的感染，尽管对蝙蝠冠状病毒 HKU4 和 BtCoV/Ii/GD/2014 - 422 的中和作用减弱或完全没有。相比之下，3B11 抗体对这些病毒没有中和活性。这表明工程化 DPP4 对多种 MERS-CoV 变种和某些其他 merbecoviruses 具有治疗潜力。

工程化 DPP4 诱饵对感染 MERS-CoV 小鼠的保护作用

评估工程化 DPP4 在小鼠体内的药代动力学特性，静脉注射后，其在慢消除相的血浆半衰期为 48.9h，比 ACE2 诱饵的 25.8h 更长，这意味着它在体内更稳定，有望产生更好的抗病毒效果。

由于野生型小鼠对 MERS-CoV 感染不敏感，研究人员在表达人 DPP4（hDPP4）的小鼠模型中评估工程化 DPP4 的抗病毒效果。该模型在感染 MERS-CoV 后，肺部病毒滴度和炎症在第 3 天达到高峰，然后自发消退。

研究人员通过吸入方式给小鼠施用 DPP4 诱饵，在鼻内感染 1×10⁵ 空斑形成单位（PFUs）的 MERS-CoV 前 3h，给小鼠施用 200μg 的工程化 DPP4 诱饵。感染后 1 天和 3 天收集肺组织，发现 DPP4 诱饵吸入显著降低了病毒基因组 RNA 和亚基因组 RNA 的浓度，感染性病毒载量也明显降低或检测不到。组织病理学分析显示，吸入工程化 DPP4 诱饵的小鼠肺部炎症和病毒抗原显著减少。

更重要的是，评估感染后 24h 施用 DPP4 诱饵的治疗效果，发现吸入和腹腔注射都能在感染后 3 天适度但显著地降低肺匀浆中的感染性病毒。

讨论

MERS-CoV 通过其刺突蛋白与细胞受体 DPP4 结合进入宿主细胞，释放基因组 RNA 并启动转录和复制过程。单克隆抗体作为病毒进入抑制剂存在局限性，病毒刺突基因的突变会导致逃逸突变，使其对中和抗体产生适应性。例如，在 SARS-CoV-2 感染中，各种干预措施都无法对连续出现的变种保持持续疗效，本研究中用作对照的 3B11 抗体也出现了对韩国变种失去有效中和的情况。

工程化 DPP4 诱饵通过氨基酸取代增加了对刺突蛋白的结合亲和力，并消除了肽酶活性，是对抗高突变率病毒的合理策略。因为病毒如果逃避这些诱饵，就无法结合细胞表面受体，从而失去感染宿主细胞的能力。之前开发的 ACE2 诱饵对奥密克戎亚变种仍然有效，且在病毒培养中未观察到逃逸突变，证实了受体诱饵策略的优越性。本研究表明，该策略同样适用于针对 MERS-CoV 的 DPP4。

DPP4 是一种 II 型跨膜蛋白，存在多种构型，在构建人 IgG1 - Fc 融合物时，N 端融合优于 C 端融合，且 IgG1 - Fc 能诱导更稳定的二聚化。与 ACE2 诱饵相比，DPP4 诱饵的热稳定性显著增强，在蛋白质合成过程中无需纯化去除聚集体，有利于药物开发。在 DPP4 和 ACE2 中，N - 聚糖都会干扰病毒结合，引入去糖基化突变可增加亲和力，且不影响蛋白质的折叠、稳定性和细胞内运输等功能。

本研究使用的 MERS 动物模型是将 MERS-CoV 祖先株感染通过内源性 DPP4 启动子表达 hDPP4 的小鼠，该模型仅表现出轻度肺部病理，可能导致工程化 DPP4 的保护作用不明显。其他研究使用通过 CAG 启动子表达 hDPP4 的小鼠或小鼠适应的 MERS-CoV 构建的致死模型，可能会更明显地显示出工程化 DPP4 的保护作用。尽管存在这些局限性，鉴于工程化 DPP4 的广谱疗效和优越的物理性质，它是应对 MERS-CoV 感染威胁和未来病毒变种出现的有力治疗手段，也是储备医疗资源以应对未来人畜共患病传播的有前途的途径。

研究方法

研究中涉及多种细胞培养，包括 Lenti-X 293T 细胞、Vero E6 细胞和 Huh-7 细胞等，在特定培养基中培养，并定期检测支原体污染。

构建多种质粒，将人 DPP4、各种冠状病毒的刺突蛋白、RBD 等克隆到相应载体中。

在 Expi293F 细胞中表达可溶性蛋白，用 rProtein A Sepharose 和 Ni - NTA Agarose 分别纯化 Fc 融合和 His 标记的蛋白，透析后进行后续实验。

通过易错 PCR 构建 DPP4 突变体文库，经一系列处理后转化到电感受态细胞中，评估突变体文库规模。

利用流式细胞术对转染后的细胞进行分析，包括检测 DPP4 与 RBD 的结合情况以及进行竞争抑制实验等。

使用 Biacore T200 仪器进行表面等离子共振分析，测定蛋白质的结合动力学。

通过差示扫描荧光法评估 sDPP4 蛋白的热稳定性，绘制热变性曲线并确定 Tm 值。

进行 Pull - down 实验分析蛋白质的结合情况，使用荧光法检测 DPP4 的催化活性。

构建假型病毒中和实验检测诱饵蛋白对假病毒的中和能力，在生物安全 3 级条件下培养和滴定真实的 MERS-CoV，并进行中和实验。

对工程化 DPP4 进行单剂量药代动力学研究，在表达 hDPP4 的转基因小鼠模型中进行感染实验，通过定量 RT - PCR 检测病毒 RNA，进行逃逸突变研究、组织染色和免疫组化分析、ELISA 检测细胞因子水平，并使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析。

研究资源与数据可用性

进一步的信息和资源材料请求可联系主要联系人 Atsushi Hoshino（a - [e-mail] - m.ac.jp）。本研究未产生新的独特材料，支持研究结果的数据在文章及其补充信息中，可向相应作者合理索取，文章未报告原始代码。

综上所述，这项研究成功开发了工程化 DPP4 诱饵，对 MERS-CoV 及其变种和相关病毒具有显著的中和效果，在抗病毒治疗方面展现出巨大的潜力，为未来应对 MERS-CoV 感染及相关公共卫生问题提供了新的思路和方法。