旋毛虫与伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构与抑制活性研究：为抗寄生虫治疗提供新契机

研究人员解析旋毛虫和伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins）结构，发现其抑制活性差异，为抗寄生虫药和疫苗研发奠基。

　　在全球范围内，旋毛虫病是一种广泛传播的寄生虫感染性疾病，严重威胁人类和动物健康。旋毛虫（Trichinella spiralis）不仅能感染人类，还可在野生和家养动物体内完成生命周期，其引发的临床症状多样，严重时甚至会导致死亡。为了在宿主环境中生存，旋毛虫必须躲避宿主的各种防御机制，其中丝氨酸蛋白酶（serine proteases）在宿主的消化和免疫反应中起着关键作用，而旋毛虫分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins）则在宿主 - 寄生虫相互作用中扮演着重要角色，对调节宿主消化丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和糜蛋白酶等发挥着重要作用。因此，深入研究旋毛虫 serpins 的结构和功能，对于理解寄生虫的生存机制、开发新的治疗方法和疫苗具有重要意义。

天津医科大学的研究人员针对这一问题展开了深入研究，相关成果发表在《Cell & Bioscience》杂志上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：

1. 蛋白质表达与纯化：将旋毛虫和伪旋毛虫的 serpin 基因分别克隆到特定表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，随后通过多种色谱技术进行纯化，获取高纯度的目标蛋白。
2. 结晶、数据收集和处理：采用悬滴法使蛋白结晶，在上海同步辐射光源收集衍射数据，经处理和分析确定蛋白晶体结构。
3. 酶活性抑制测定：通过设置不同实验组，测定 serpin 及其突变体对 α - 糜蛋白酶的抑制率、抑制动力学参数（如抑制常数Ki?和k3? ）、半抑制浓度IC50?以及抑制化学计量数（SI）等，评估其抑制活性。

研究结果如下：

1. Ts - serpin 和 Tp - serpin 的结构：成功解析了 Tp - serpin（氨基酸 3 - 377）和 Ts - serpin（氨基酸 2 - 373）的晶体结构。Tp - serpin 是单体，由三个 β - 片层和九个 α - 螺旋组成，RCL（Reactive center loop，反应中心环）部分无序；Ts - serpin 则有两个分子存在于每个晶体学不对称单元中，其结构与 Tp - serpin 有相似之处，但也存在差异，如缺少 G - 螺旋，拥有延长的 C 末端序列等。通过结构保守性分析发现，二者都具有典型的 serpin 结构特征。
2. Ts - serpin 和 Tp - serpin 关键结构域的分析与比较：对 RCL、铰链区、breach（裂口）和 shutter（快门）等关键结构域进行分析，发现 Tp - serpin 和 Ts - serpin 的 RCL 结构和与底物结合的方式存在差异，可能影响其抑制活性。例如，Ts - serpin 的铰链区部分插入到 β - 片层 A 中，使得 RCL 暴露长度缩短，可能导致其抑制活性低于 Tp - serpin。同时，二者的 breach 和 shutter 区域虽有相似性，但也存在一些不同，这些区域对调节 serpin 的构象变化和抑制活性至关重要。
3. 天然 Ts - serpin 和 Tp - serpin 及其突变体的酶抑制作用：实验测定结果表明，Tp - serpin 和 Ts - serpin 对 α - 糜蛋白酶都有良好的抑制效果，且二者的抑制活性相近，但 Tp - serpin 略高。突变实验证实，RCL 区域的 P1 和 P1′氨基酸残基是决定抑制机制的关键位点，突变后 serpin 的抑制活性显著降低。此外，研究还发现温度和 pH 对 serpin 和蛋白酶的活性有影响，在 30 - 42°C、pH 6.0 - 10.0 范围内，二者对 α - 糜蛋白酶的抑制活性较高，最佳反应温度为 37°C，最佳反应 pH 为 8.0。
4. Ts - serpin 和 Tp - serpin 构象变化的预测：基于 serpin 通过自杀底物抑制机制使目标蛋白酶失活的原理，推测了 Tp - serpin 和 Ts - serpin 的构象变化模型。Tp - serpin 的 RCL 能与目标蛋白酶相互作用，其铰链区通过与 β - 片层 A 相互作用稳定构象；而 Ts - serpin 的 RCL 可能代表一种中间状态，其 β - 片层 A 不太稳定。

研究结论和讨论部分指出，研究人员成功解析了旋毛虫和伪旋毛虫 serpin 的天然构象晶体结构，揭示了它们的结构特征和抑制活性差异。serpin 通过 RCL 与目标蛋白酶相互作用，其抑制活性与 RCL 的序列和结构密切相关。在旋毛虫和伪旋毛虫感染宿主的早期阶段，其 serpins 可能通过抑制宿主肠道中的消化酶活性，阻断宿主免疫反应，同时降低自身免疫原性，帮助寄生虫逃避宿主的免疫调节。这些发现表明 serpins 有可能成为潜在的药物靶点，通过研究其结构可以发现关键表位，为开发抗寄生虫疫苗提供直接证据。此外，对 serpins 进行工程改造，有望恢复功能异常的蛋白酶活性，为治疗多种疾病开辟新的途径，具有重要的理论和实际应用价值。