新发现：AP-5 复合体相关基因变异引发视网膜疾病的机制与意义

本文揭示了 AP5Z1、AP5M1 和 AP5B1 基因双等位基因变异是隐性 IRD 的独立病因，对疾病研究意义重大。

　　

一、研究背景

遗传性视网膜疾病（Inherited retinal diseases，IRDs）是一类遗传异质性的孟德尔遗传病，常导致进行性视力丧失，涉及约 300 个不同基因。虽然这些基因位点的变异构成了大多数分子诊断，但仍有其他与 IRDs 相关的基因有待确定。

IRDs 根据受影响的细胞类型和视网膜变性模式，可分为多种临床类型，如视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）、锥杆营养不良（cone - rod dystrophy，CRD）和黄斑营养不良（macular dystrophy，MD）等。MD 主要影响视网膜中央区域的黄斑，导致中心视力下降、畏光、视物变形等症状。在已知与 IRDs 相关的约 300 个基因中，与 MD 相关的基因较少，其中与隐性 MD 相关的仅有 4 个。

IRDs 的遗传模式复杂，包括常染色体隐性、常染色体显性、X 连锁和线粒体遗传等。目前，IRD 分子遗传学虽取得进展，但由于技术限制、DNA 变异优先级判断困难以及未发现的疾病相关基因和通路等因素，仍有相当比例的患者无法明确基因诊断，分子诊断率在 50% - 80% 之间波动。

溶酶体贮积病（Lysosomal storage diseases，LSDs）由 50 多个不同基因的孟德尔变异引起，最终导致溶酶体功能受损和细胞废物异常降解，引发代谢副产物积累和细胞损伤。一些与 LSDs 相关的基因，也与非综合征性 IRDs 有关，如 CLN3、HGSNAT 和 MFSD8 等。

第五衔接蛋白（AP - 5）复合体在细胞内运输中起关键作用，尤其是在晚期内体到高尔基体的回收网络中对蛋白质进行分类和运输，这一过程对维持细胞内稳态和确保溶酶体途径正常运作至关重要。AP - 5 复合体由四个亚基组成，分别由 AP5Z1、AP5M1、AP5B1 和 AP5S1 基因编码。此前，仅 AP5Z1 基因的致病变异与隐性遗传性痉挛性截瘫 48 型（SPG48）相关，其他 AP - 5 复合体成分的具体功能和病理生理学机制尚不清楚。

二、材料和方法

1. 研究对象和样本采集：研究遵循赫尔辛基宣言，经各机构伦理委员会批准。研究人员从 9 个国家的 19 个无关家庭中选取 22 名受影响个体，收集其全血或唾液样本用于 DNA 提取，并对所有受试者进行眼科评估，分析相关临床记录。
2. 基因测序和数据分析：采用全外显子测序（Whole - exome sequencing，WES）和全基因组测序（Whole - genome sequencing，WGS）技术，不同机构遵循特定但有共同结构的协议进行。对测序结果进行生物信息学分析，使用 VariantValidator 验证变异，按照人类基因组变异协会（HGVS）命名法命名，并依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）标准分类。从 gnomAD 数据库（v.2.1.1）下载 DNA 变异频率，通过直接分析 BAM 文件、IGV 和 / 或 OFF - PEAK 确认纯合子为双等位基因。利用 Canvas 和 / 或 Manta 算法检测结构大改变，使用靶向单核苷酸多态性（SNP）阵列验证特定变异。通过 T - Coffee、Expresso 和 AlphaFold 进行蛋白质比对和结构预测。
3. 疾病患病率估计：利用 GeniE 工具，根据 gnomAD v.2.1.1 中手动整理的变异列表，估计 AP5 相关疾病的患病率。依据 ACMG 指南的 PVS1 标准，确定真正的功能丧失（LoF）等位基因。
4. 靶向桑格测序：使用桑格测序法验证短读长测序结果，并进行家族内分离分析。利用 Primer3Plus 设计引物，进行 PCR 扩增，对 PCR 产物处理后进行测序，将测序结果与人类参考序列（Ensembl，GRCh37）比对。
5. RNA 分析：为检测 AP5Z1 基因中 c.1595G>T（M2）变异对剪接的影响，采集携带该变异的患者和对照个体的外周血，提取总白细胞 RNA，合成 cDNA 后进行 RT - PCR 扩增，对扩增产物进行测序或克隆测序。
6. 免疫染色实验：收集人类视网膜色素上皮（Retinal pigment epithelium，RPE）扁平 mounts，固定后进行免疫荧光染色，使用特定的一抗和二抗，用 DAPI 染核，用鬼笔环肽 - iFluor 647 共轭物染肌动蛋白丝，通过共聚焦显微镜成像。对人诱导多能干细胞来源的 RPE（iPSC - RPE）细胞进行分化培养，固定后进行免疫荧光染色，使用多种标记物和二抗，通过不同显微镜成像并进行图像处理。

三、研究结果

1. 临床特征：22 名受影响个体均表现为常染色体隐性遗传的进行性 MD。发病年龄平均在 45 岁左右，早期症状包括中心视力下降、视物变形等，疾病进展过程中，从早期的斑点状病变，发展到中期的部分视网膜萎缩，晚期则出现中央脉络膜视网膜萎缩，伴有周边视网膜的特征性改变，如网状色素聚集、外层视网膜管状化等。尽管部分患者疾病严重，但周边视网膜功能相对保留，ERG 未熄灭。约一半患者有眼外症状，包括神经系统症状（如帕金森症、周围神经病变等）和听力障碍等，且同一家庭中携带相同基因型的个体眼外症状存在差异。
2. 遗传分析：所有先证者在先前确定的 IRD 相关基因中均未检测到致病性变异。通过新的 WES、WGS 筛查或重新分析先前测序数据，在 AP5Z1（14 个家庭）、AP5M1（3 个家庭）和 AP5B1（2 个家庭）基因中发现双等位基因变异。共检测到 23 个不同变异，其中 22 个为推测的 LoF 变异，且多数变异未在 ClinVar 或生物医学文献中报道。通过分析 gnomAD 中 LoF 等位基因频率，估计 AP5Z1 相关疾病患病率为 1/471,000，AP5B1 相关疾病为 1/590 万，AP5M1 相关疾病为 1/650 万，若 AP5S1 基因变异与疾病相关，其患病率极低，为 1/1.05 亿，所有 AP - 5 相关疾病综合患病率为 1/407,000。
3. 各基因变异情况
   • AP5Z1 基因变异：在多个家庭中发现不同的 AP5Z1 基因变异。如葡萄牙家庭 1 中，三名患者携带 c.1836_1839dup（p.Leu614TyrfsTer150）和 c.1595G>T（p.Ser486_Arg532del）变异；以色列家庭 3 中，患者携带 c.2086dup（p.Gln696ProfsTer67）变异，且该家庭中其他患 RP 的亲属携带 EYS 基因的不同变异。不同家庭的变异类型多样，包括无义变异、移码变异、剪接位点变异和基因缺失等。
   • AP5M1 基因变异：三个家庭的先证者携带 AP5M1 基因变异。如瑞士的 P18 携带 c.97C>T（p.Arg33Ter）变异，比利时的 P19 携带 c.1166G>A（p.Trp389Ter）变异，德国的 P20 携带 c.938A>G（p.Tyr313Cys）变异，其中 c.938A>G 是研究中唯一的真正错义变异，且影响保守氨基酸残基，被预测为有害变异。
   • AP5B1 基因变异：希腊的 P21 和英国的 P22 分别携带 AP5B1 基因变异。P21 为 c.310del（p.Leu104TrpfsTer54）变异的纯合子，P22 可能为 c.463C>T（p.Arg155Ter）和 c.862del（p.Gln288SerfsTer29）变异的复合杂合子，这些变异虽位于基因最后一个外显子，但可能导致蛋白质功能完全丧失。
4. M2 变异的功能验证：M2 变异（c.1595G>T）虽理论上导致错义突变，但经四种计算机工具预测影响前体 mRNA 剪接。通过对患者和对照个体的 RNA 分析，证实 M2 导致 AP5Z1 基因外显子 12 跳过，产生异常转录本，导致 47 个氨基酸缺失，被分类为可能致病的剪接改变变异。
5. AP - 5 复合体成分的定位：在人 RPE 扁平 mount 切片和 iPSC - RPE 单层细胞中，AP5Z1、AP5M1 和 AP5B1 均呈现点状标记，主要位于细胞质中。在 iPSC - RPE 单层细胞中，它们与晚期内体标记物 Rab7 和反式高尔基体网络标记物 TGN46 共定位，与溶酶体标记物 LAMP2、早期内体标记物 EEA1 和回收内体标记物 TfR 无明显共定位，且主要分布在细胞顶端，可能形成管状结构。

四、讨论

本研究中，所有受影响个体均表现出一致的视网膜表型，疾病早期有斑点，中期部分视网膜萎缩，晚期完全脉络膜视网膜萎缩。这种模式与其他 IRD（如 ABCA4 相关视网膜病变）不同，具有独特的特征。

研究发现的 23 个独特变异中，多数为未报道过的 LoF 变异，支持其致病作用。部分变异（如 M2、M3 和 M8）在欧洲人群中可能较早出现且相对普遍。尽管部分变异与 SPG48 相关，但在本研究中，多数患者主要表现为非综合征性 IRD，未出现明显的眼外症状，且未发现明确的基因型 - 表型相关性。

AP - 5 复合体在细胞内运输和维持溶酶体稳态中起重要作用。其功能异常会导致异常内溶酶体积累、蛋白质回收障碍和溶酶体功能受损，与 LSDs 的病理特征相似。AP - 5 复合体还与其他参与内体 - 溶酶体途径的蛋白相互作用，相关疾病的视网膜表型也有相似之处。

RPE 在维持视网膜健康中至关重要，其功能包括吞噬光感受器外段碎片和进行自噬。AP - 5 复合体可能参与调节 RPE 的自噬通量，其功能受损会导致未降解的自噬货物积累，引发细胞应激和退化。已有研究表明，针对溶酶体途径的治疗策略在其他视网膜疾病中具有潜力，这也为 AP - 5 相关疾病的治疗提供了思路。

本研究首次揭示了 AP - 5 复合体在视网膜组织中的定位和潜在作用，但未明确其与黄斑变性的直接联系。未来需要进一步研究，以确定 AP - 5 相关视力丧失的精确分子病因，开发针对此类疾病的治疗方法。由于该疾病的独特临床和分子特征，研究人员建议将其指定为 IRD 的一个独特临床亚型 ——“溶酶体黄斑营养不良”。这一疾病亚型可能与其他 LSDs、衔接蛋白病和其他形式的视网膜失明共享分子病理机制，为未来采用共同治疗策略提供了可能性。

五、研究总结

通过多国多中心的合作研究，研究人员确定了 AP5Z1、AP5M1 和 AP5B1 基因的致病性变异是一种隐性视网膜疾病的独立病因，该疾病以黄斑光感受器进行性丧失为特征。这一发现拓宽了先前描述的衔接蛋白病的范围，为进一步研究 IRD 的发病机制和治疗策略提供了新的方向。同时，将该疾病指定为 “溶酶体黄斑营养不良”，有助于更准确地诊断和分类此类疾病，推动相关研究的发展。