IGF-1 与 EWS::FLI1协同驱动尤文肉瘤发生机制及联合治疗新策略

本文揭示尤文肉瘤（EwS）中 IGF-1 与 EWS::FLI1协同促瘤机制，为联合靶向治疗提供理论依据。

　　### 尤文肉瘤研究背景
尤文肉瘤（EwS）是一种侵袭性很强的青少年骨与软组织癌症，发病高峰期在青春期。局限性 EwS 患者 5 年无病生存率约 70%-80%，但有转移的患者 5 年生存率仅 20%-30% ，目前急需更有效的治疗方法。

EwS 的特征是 22 号染色体上的 EWSR₁基因与 ETS 转录因子家族基因（最常见的是 FLI₁）发生染色体易位，产生的融合基因编码致癌转录因子 EWS::FLI₁（EF）。EF 能结合并打开 GGAA 重复序列，使其成为转录增强子，调控大量与细胞增殖和转化相关的基因表达。虽然对 EF 驱动的基因调控机制有较多了解，但由于 EF 对大多数细胞类型和身体组织具有毒性，构建 EwS 的遗传小鼠模型仍具有挑战性。

此外，胰岛素样生长因子 - 1（IGF-1）是 EwS 的自分泌生长因子，EF 可直接激活 IGF-1 启动子，并抑制 IGF-1R 信号调节通路。然而，在临床试验中，只有 10%-14% 的患者对 IGF-1R 靶向治疗有反应，部分原因是胰岛素受体信号通路的上调。目前，EwS 发病早期阶段 IGF-1 / 胰岛素信号通路的状态和作用尚不清楚。

研究目的

本研究旨在探究 EwS 的发病机制，确定胚胎起源干细胞及其发育阶段，以及青春期骨微环境中的内分泌环境在 EwS 发病中的作用。同时，研究 EF 和 IGF-1 在间充质干细胞（MSC）转化中的相互作用，为 EwS 的治疗提供新的策略。

实验方法

1. 构建小鼠模型：通过将携带 loxP-STOP-loxP - 血凝素（HA）标记的 EF 盒的小鼠与 Prx1-Cre 转基因小鼠杂交，使 EF 在间充质谱系中表达，观察其对骨骼发育的影响。
2. 细胞实验：从 EF 突变小鼠和野生型小鼠的肢体中分离并培养 MSCLCs，进行细胞增殖、分化、软琼脂实验、RNA 测序（RNA-seq）、转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）等实验，研究 EF 和 IGF-1 对 MSCLCs 的影响。
3. 体内实验：将 EF^Prx1 MSCLCs 和 hr-EF^Prx1 MSCLCs 皮下注射到 SCID 小鼠中，观察肿瘤形成情况。
4. 药物实验：使用 IGF-1R 抑制剂 NVP-AEW541 和 YAP/TEAD 抑制剂 K-975 处理细胞，进行药物协同实验，评估联合治疗的效果。

实验结果

1. 胚胎期 EF 表达影响骨骼发育：EF^Prx1小鼠表现出严重的骨骼畸形，包括多指、短肢、颅面畸形和肋骨笼闭合不全等。这些小鼠在出生后约 12 小时内死亡，表明 EF 诱导了 MSCLCs 在软骨细胞早期阶段的发育分化停滞。
2. EF^Prx1 MSCLCs 的特征：EF^Prx1 MSCLCs 稳定表达 EF 蛋白，与野生型 MSCLCs 在形态和免疫表型上相似，但在分化能力上存在差异。EF^Prx1 MSCLCs 保留了软骨细胞分化潜力，但无法分化为脂肪细胞和成骨细胞谱系。RNA-seq 分析发现，EF^Prx1 MSCLCs 中多个抗凋亡 Bcl2 家族成员下调，同时富集了人类 EF 特征基因集。ATAC-seq 分析表明，EF^Prx1 MSCLCs 中染色质可及性发生改变，GGAA 微卫星在差异开放区域富集。
3. IGF-1 促进 EF^Prx1 MSCLCs 的转化：虽然 EF^Prx1 MSCLCs 是永生的，但在软琼脂中无法形成集落。当暴露于模拟人类青春期血清 IGF-1 水平（500 ng/mL）时，EF^Prx1 MSCLCs 能够形成集落，且这些集落来源的细胞（ha-EF^Prx1 MSCLCs）在去除激素后仍能保持锚定非依赖性生长能力，即成为稳定转化的 hr-EF^Prx1 MSCLCs。hr-EF^Prx1 MSCLCs 在 SCID 小鼠中可形成具有 EwS 样小圆形细胞形态的肿瘤，而未处理的亲本 EF^Prx1 MSCLCs 形成的肿瘤较少且较小，潜伏期较长。
4. IGF-1 重编程对转录组和染色质的影响：RNA-seq 分析显示，与亲本 EF^Prx1 MSCLCs 相比，ha-EF^Prx1和 hr-EF^Prx1 MSCLCs 中分别有 1,328 和 1,079 个基因上调，2,126 和 1,732 个基因下调。这些差异表达基因显著富集在人类 EwS 衍生的 EF 靶基因集中，但 IGF-1 重编程对 EF 在 GGAA 重复区域的新形态活性影响不大。ATAC-seq 分析发现，hr-EF^Prx1 MSCLCs 与亲本 EF^Prx1 MSCLCs 相比，染色质可及性区域变化较少，且开放染色质区域中 GGAA 微卫星没有进一步富集。
5. IGF-1 处理相关的染色质可及性变化机制：通过对不同处理组 MSCLCs 的染色质可及性区域进行比较聚类分析，发现了五个不同的模块（M1 - M5）。M2 模块中 Yap1 和 Lama5 等基因显著上调，且该模块富含 GGAA 微卫星和视黄酸受体相关孤儿核受体家族结合基序。Yap1 在 hr-EF^Prx1 MSCLCs 的细胞质和细胞核中均有诱导表达，敲除 Yap1 可导致 hr-EF^Prx1 MSCLCs 几乎完全丧失集落形成能力。
6. EF 和 IGF-1 信号协同激活 TEAD 靶基因：Tead 转录因子的活性需要 Yap1 的共激活，研究发现 EF 和 IGF-1 信号通过分步激活 TEAD 靶基因，促进 MSCLCs 的恶性转化。Yap1 敲除可导致多个与 EwS 生物学功能相关的 M4 基因（如 Igf2bp1、Hpf1、Cenpq 和 Ccnd1）下调。此外，抑制 YAP/TEAD 相互作用（如使用 K-975）可显著降低 hr-EF^Prx1 MSCLCs 的集落形成能力，并与 IGF-1R 抑制协同抑制 hr-EF^Prx1细胞和人类 EwS 细胞系的生长。

研究结论

本研究揭示了 EwS 发病过程中 IGF-1 驱动的肿瘤促进模块化机制，其中 Yap1 起着核心作用。在胚胎期，EF 表达导致间充质前体的转录组重编程，使细胞发育停滞并永生，但不足以介导完全转化。青春期时，高浓度的 IGF-1 / 胰岛素短暂刺激，诱导 Yap1 表达，激活关键的干细胞和细胞周期相关基因，促进肿瘤发生。

基于这些发现，联合抑制 IGF-1R 和 YAP/TEAD 有望成为治疗 EwS 患者的有效策略。然而，本研究也存在一些局限性，如未在体内正式测试与青春期的联系，IGF-1 短暂暴露永久激活 Yap1 转录的机制尚不清楚，且所使用的先导药物 K-975 在体内具有较高毒性。未来需要进一步研究来解决这些问题，推动 EwS 治疗的发展。