PHLPP1：肺纤维化治疗的新希望 —— 调控肺泡巨噬细胞的关键因子

本文揭示了 PHLPP1 在肺泡巨噬细胞（AMs）中对肺纤维化的保护作用及机制，为治疗提供新策略。

　　### 引言
特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进行性的肺部疾病，其特征为细胞外基质（ECM）过度沉积、气体交换受损，最终可导致呼吸衰竭和死亡。作为最常见的纤维化肺部疾病，IPF 预后较差，目前尚无有效的治疗方法，严重威胁着全球近三百万人的健康。

肺泡巨噬细胞（AMs）是维持肺部稳态的重要组织驻留免疫细胞，但它们也被广泛认为是肺部疾病发病机制的主要参与者。在局部免疫微环境的影响下，AMs 可极化为具有异常修复表型的替代激活巨噬细胞，甚至在有害化学物质和呼吸道病原体（如 SARS - COV - 2）介导的反复肺泡上皮损伤时，发挥致病性促纤维化作用。因此，了解 AMs 失控的促纤维化效应的潜在机制具有重要意义。

表观遗传学是指在不改变 DNA 序列的情况下，基因功能发生的可遗传变化，包括 DNA 甲基化、染色质重塑、RNA 和组蛋白修饰等。表观遗传重编程的失调在 IPF 的发病过程中起着重要作用。越来越多的证据表明，异常的组蛋白甲基化和乙酰化通过抑制抗纤维化基因的表达，促进 IPF 的进展。例如，转化生长因子（TGF） - β1 通过调节 DNA 甲基化和组蛋白 H3 赖氨酸 4 三甲基化（H3K4me3），抑制小窝蛋白 - 1 的表达，导致致病性成纤维细胞增殖和抗凋亡。组蛋白甲基转移酶 G9a 和 zeste 同源物 2（EZH2）介导环氧化酶 - 2 基因启动子上的抑制性 H3K9me3 和 H3K27me3 修饰，抑制其转录，诱导抗纤维化介质前列腺素 E2 的缺失，进而促进纤维化进程。

Kruppel 样因子 4（KLF4）是纤维化疾病进展中诱导表达的关键转录因子（TF），它在单核细胞分化和 M2 AMs 的转录编程中发挥着重要作用。然而，KLF4 在不同间充质细胞群体中对肺纤维化病理的作用存在争议，其在纤维化发病机制中的转录调控和功能仍不清楚。

Pleckstrin 同源结构域和富含亮氨酸重复序列（LRR）的蛋白磷酸酶 1（PHLPP1）属于丝氨酸（Ser）/ 苏氨酸（Thr）磷酸酶家族，在细胞特性和功能中发挥着重要作用。其功能异常通常会导致多种病理疾病，包括代谢紊乱、神经系统异常、心血管疾病和肿瘤等。尽管已有研究揭示了 PHLPP1 在多种疾病中的作用，但它在 IPF 进展中的作用尚未明确。

在本研究中，研究人员发现 AMs 中 PHLPP1 表达的降低与肺纤维化患者和小鼠的组织损伤及纤维化密切相关。PHLPP1 通过调节 KLF4 的诱导表达，抑制巨噬细胞的促纤维化表型。核内的 PHLPP1 直接结合并使组蛋白去乙酰化酶 8（HDAC8）在丝氨酸 39 位点去磷酸化，导致 KLF4 基因启动子的染色质重塑和组蛋白去乙酰化。这一发现表明，靶向 PHLPP1 - KLF4 轴在治疗肺纤维化方面具有潜在的应用价值。

结果

1. PHLPP1 表达降低与肺纤维化疾病严重程度相关
   为了探究 PHLPP1 的表达在肺纤维化过程中是否失调，研究人员首先分析了公共微阵列数据集中肺纤维化患者和健康对照者的 PHLPP1 基因表达情况。结果显示，与健康对照组相比，IPF 或间质性肺疾病（ILD）等肺纤维化疾病患者的肺组织、支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）中，PHLPP1 的表达显著降低。而且，PHLPP1 的表达与肺纤维化的两个主要指标 ——I 型胶原 α1（COL1A1）和 III 型胶原 α1（COL3A1）的表达呈负相关，这暗示了 PHLPP1 在肺纤维化发病机制中可能发挥负向作用。

在博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化小鼠模型中，肺组织中 PHLPP1 的蛋白质和 mRNA 表达水平均显著下降，同时伴随着 I 型胶原表达的升高。然而，PHLPP 磷酸酶家族的另一个成员 PHLPP2 的表达在人和小鼠的肺纤维化过程中与对照组相比没有变化。这些结果表明，PHLPP1 表达的降低在肺纤维化进展中具有特定的致病作用。

研究人员构建了 Phlpp1 常规敲除小鼠（Phlpp1^?/?），以进一步研究 PHLPP1 在肺纤维化中的作用。Masson 染色结果显示，在 BLM 诱导的肺纤维化模型中，Phlpp1^?/?小鼠的肺纤维化程度比野生型（WT；Phlpp1^+/+）同窝小鼠更严重，表现为肺结构破坏加剧、胶原沉积增加和纤维化评分升高。此外，Phlpp1^?/?小鼠肺组织中羟脯氨酸、I 型胶原和 α - 平滑肌肌动蛋白（α - SMA）的水平更高，纤维化相关基因的表达也增加。

进一步研究发现，巨噬细胞是内源性 PHLPP1 的主要来源。免疫荧光检测证实，纤维化肺组织中 F4/80⁺ AMs 的 PHLPP1 表达降低，而表面活性蛋白 C（SFTPC）阳性的肺泡上皮 II 型（AT2）细胞和 α - SMA⁺肺成纤维细胞中 PHLPP1 的表达未受影响。而且，PHLPP1 缺乏对分离的原代肺成纤维细胞的 TGF - β1 反应没有影响。这些结果表明，PHLPP1 对肺纤维化的发病机制具有防御作用。
2. AMs 中的 PHLPP1 保护小鼠免受 BLM 或 SiO₂诱导的肺纤维化和损伤
研究人员分析了公开的肺纤维化患者单细胞转录组数据，发现溶菌酶（LYZ2）主要在巨噬细胞中表达，在 AT2 细胞和其他免疫细胞中表达极少。免疫荧光染色也证实，在 BLM 诱导的小鼠肺组织中，溶菌酶主要在 F4/80⁺巨噬细胞中表达，这表明 Lyz2 - cre 小鼠在肺纤维化模型中具有巨噬细胞特异性。

为了探究 AMs 中 PHLPP1 在肺纤维化中的作用，研究人员构建了巨噬细胞条件性 Phlpp1 敲除小鼠（Phlpp1^flox/floxLyz2^cre+，简称 Phlpp1 - cKO 小鼠）。与 WT 同窝小鼠（Phlpp1^flox/flox）相比，Phlpp1 - cKO 小鼠的原代 AMs 中 PHLPP1 缺失。流式细胞术分析显示，PHLPP1 缺失不影响 AMs 在体内的发育，也不影响巨噬细胞集落刺激因子（M - CSF）诱导的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）在体外的分化。

随后，研究人员给 Phlpp1 - cKO 小鼠和 WT 小鼠注射 BLM 诱导肺纤维化。组织病理学分析（Masson 染色和 Ashcroft 评分）显示，AMs 中 PHLPP1 缺失加剧了胶原沉积和肺组织损伤。与 WT 小鼠相比，Phlpp1 - cKO 小鼠肺组织中的羟脯氨酸浓度更高，I 型胶原和 α - SMA 的表达增加，纤连蛋白 1（Fn1）mRNA 的表达也升高。

研究人员还研究了 PHLPP1 对二氧化硅诱导的矽肺（另一种广泛接受的实验性肺纤维化模型）的影响。结果发现，与 WT 小鼠相比，Phlpp1 - cKO 小鼠肺组织中的矽肺结节和胶原沉积增加，肺功能障碍加剧，纤维化分子（如 I 型胶原和 α - SMA）的表达也增加。

为了确定 PHLPP1 的抗纤维化作用主要发生在 AMs 中，研究人员对 BLM 暴露的小鼠进行气管内注射氯膦酸盐包封的脂质体，选择性地清除肺中的 AMs。结果表明，AMs 的消耗有效地逆转了 Phlpp1 - cKO 小鼠严重的肺纤维化发病机制，包括减少胶原沉积、羟脯氨酸含量、I 型胶原和 α - SMA 蛋白表达以及纤维化基因表达。这些结果表明，PHLPP1 以 AMs 内在的方式保护小鼠免受 BLM 或 SiO₂诱导的肺纤维化和损伤。
3. PHLPP1 缺乏促进 IL - 4 介导的巨噬细胞替代激活和纤维化反应
越来越多的证据表明，纤维化组织中替代激活的巨噬细胞与促纤维化表型相关，它们通过多种免疫抑制膜受体或分泌蛋白，在肺纤维化的发病机制中发挥重要作用。研究人员检测了 Phlpp1 - cKO 小鼠和 WT 小鼠肺组织中几种代表性的巨噬细胞 M2 基因（包括精氨酸酶 - 1（Arg1）、抵抗素样 α（Retnla）和 Tgfb1）的 mRNA 表达。结果显示，PHLPP1 缺乏显著上调了这些促纤维化基因的表达，以及肺组织中 Arg1 蛋白的表达。

免疫荧光检测证实，PHLPP1 缺陷小鼠的 BLM 模型肺组织中，M2 巨噬细胞（F4/80⁺CD206⁺）的浸润更为明显，但对 M1 巨噬细胞（F4/80⁺CD86⁺）的数量没有影响。流式细胞术分析也显示，PHLPP1 缺陷小鼠的 AMs 中，CD206⁺ M2 巨噬细胞的频率显著增加。

研究人员进一步分析了原代 AMs 的转录组测序数据，发现 PHLPP1 对巨噬细胞效应转录程序有显著影响，尤其是涉及含胶原 ECM、细胞趋化和细胞因子 - 细胞因子受体相互作用的基因。在 BLM 处理的小鼠中，PHLPP1 缺陷的原代 AMs 中促纤维化基因（如 Arg1、Retnla 和 Tgfb1）的 mRNA 表达增加，免疫印迹和免疫荧光检测也证实了 PHLPP1 缺陷的 AMs 中 Arg1 蛋白水平上调。

最后，研究人员将 BLM 或 PBS 处理的 Phlpp1 - cKO 小鼠和 WT 小鼠的 AMs 与原代肺成纤维细胞在 Transwell 系统中共培养。结果发现，与 PHLPP1 缺陷的 AMs 共培养促进了肺成纤维细胞中 Col1、α - SMA 等纤维化基因的表达，以及细胞的表型转化。这些结果表明，PHLPP1 负向调节替代激活巨噬细胞的促纤维化功能，防止肺成纤维细胞的致病性转化。

II 型细胞因子白细胞介素（IL） - 4 是一种已知的触发巨噬细胞替代激活的细胞因子，与 II 型免疫相关的病理过程（如过敏、哮喘和纤维化）有关。研究人员发现，BLM 诱导的肺纤维化模型中，BALF 中的 IL - 4 水平显著上调。为了证实 PHLPP1 在巨噬细胞替代激活中的调节作用，研究人员在体外对原代 BMDMs 进行 IL - 4 处理。结果显示，IL - 4 处理下调了 PHLPP1 的表达，而 TGF - β1 处理对其没有影响。

对 IL - 4 处理的原代 BMDMs 进行 RNA - seq 分析发现，PHLPP1 缺陷导致 BMDMs 在 IL - 4 刺激 12 小时或 24 小时后的转录组发生类似改变，上调的基因大多在两个 RNA - seq 组中相同。基因集富集分析（GSEA）表明，Phlpp1 - cKO BMDMs 中显著富集的基因与 ECM 受体和 ECM 合成相关。在 PHLPP1 缺陷的巨噬细胞中，IL - 4 刺激共同上调的基因包括 Arg1、几丁质酶样 3（Chil3）、Retnla、甘露糖受体 1（Mrc1；也称为 Cd206）等许多经典的 M2 膜蛋白、细胞因子和趋化因子。qPCR 和免疫印迹检测也验证了 RNA - seq 的结果。在 IL - 4 处理的 PHLPP1 缺陷的 AMs 中也观察到类似现象。流式细胞术分析进一步证实，PHLPP1 缺陷促进了 IL - 4 刺激后 BMDMs 中 Mrc1/CD206 的表达。IL - 4 诱导的促纤维化基因表达在通过小干扰 RNA（siRNA）转染沉默 Phlpp1 的 BMDMs 中也升高。这些数据表明，PHLPP1 在体内和体外均抑制促纤维化巨噬细胞的替代激活，这是肺纤维化进展的关键致病因素。
4. 核内 PHLPP1 靶向 KLF4 抑制其在纤维化 AMs 中的表达
考虑到 PHLPP1 在调节癌细胞中 AKT 信号通路的作用，研究人员分析了 IL - 4 刺激的巨噬细胞中 AKT 的 S473 磷酸化水平，发现 Phlpp1 - cKO 和 WT BMDMs 之间没有差异。此外，虽然信号转导和转录激活因子 6（STAT6）在 IL - 4 刺激下对 M2 程序的最佳和持续发挥重要作用，但 PHLPP1 对 STAT6 的磷酸化没有明显影响。

先前的研究报道，核定位的 PHLPP1 通过调节组蛋白磷酸化和乙酰化，调节一些生长因子受体（如表皮生长因子（EGF）受体）的转录。免疫荧光检测证实，PHLPP1 主要位于 IL - 4 刺激的替代激活巨噬细胞的细胞核中。然而，染色质免疫沉淀（ChIP） - qPCR 检测显示，IL - 4 刺激并未导致 PHLPP1 与 M2 基因（包括 Arg1、Chil3 和 Mrc1）启动子的结合增加。

为了在全基因组范围内进一步分析 PHLPP1 的潜在靶基因，研究人员使用抗 PHLPP1 抗体对 IL - 4 刺激或未刺激的巨噬细胞进行切割靶点和标记（CUT&Tag）测序。结果发现，与未刺激的对照巨噬细胞相比，IL - 4 刺激的 BMDMs 和 AMs 中，PHLPP1 染色质结合信号明显增加，出现了一些染色质峰。通过 CUT&Tag 测序和转录组数据的联合分析，研究人员发现 KLF4 和干扰素调节因子 4（IRF4）这两个控制巨噬细胞纤维化表型的经典 TF，在替代激活的 AMs 和 BMDMs 中均有诱导表达，引起了他们的关注。

研究发现，IL - 4 处理诱导 PHLPP1 募集到 Klf4 基因位点，尤其是启动子区域，这在 BMDMs 和 AMs 中通过 CUT&Tag 和 ChIP 实验得到了证实。进一步分析发现，在 IL - 4 刺激下，BMDMs 中 PHLPP1 缺陷导致 KLF4 表达增加更为明显。然而，在 Irf4 基因位点未发现 PHLPP1 的染色质结合，且 Phlpp1 - cKO 和 WT 巨噬细胞中 IRF4 的 mRNA 和蛋白质表达没有变化。

在 BLM 模型中，研究人员发现 PHLPP1 缺陷的 AMs 中 KLF4 表达更高，在 BLM 处理的小鼠肺组织中也观察到 KLF4 的 mRNA 和蛋白质表达增加。免疫荧光检测发现，增加的 KLF4 蛋白主要位于 F4/80⁺细胞中，而非 F4/80^?细胞，这表明 PHLPP1 对 KLF4 在 AMs 中的表达具有特异性调节作用。此外，根据微阵列数据 GEO: GSE49072，在 IPF 患者的人 AMs 中，KLF4 和 PHLPP1 的表达水平呈强烈负相关。ChIP 实验进一步表明，PHLPP1 缺陷有效地促进了 KLF4 在促纤维化表型基因（如 Arg1、Chil3 和 Mrc1）上的富集。

为了明确上调的 KLF4 是否是 PHLPP1 缺陷介导的纤维化反应增强的原因，研究人员通过转染特异性 siRNAs 沉默巨噬细胞中 KLF4 的表达。结果显示，Klf4 沉默有效地消除了 PHLPP1 缺陷介导的促纤维化基因表达增强和 M2 巨噬细胞（CD206⁺）增加。这些数据表明，KLF4 作为巨噬细胞替代激活的主要调节因子，是肺纤维化发病机制中 PHLPP1 的下游 TF。
5. PHLPP1 通过 HDAC8 依赖的组蛋白去乙酰化和降低染色质可及性抑制 KLF4 转录
研究人员使用转座酶可及染色质高通量测序（ATAC - seq）分析了 PHLPP1 控制巨噬细胞纤维化极化的机制。结果显示，PHLPP1 缺陷导致替代激活巨噬细胞的染色质可及性增加，特别是在具有 PHLPP1 结合信号的启动子区域。在 Klf4 启动子区域发现了更多的 ATAC 信号，表明 PHLPP1 缺陷的巨噬细胞中 KLF4 的转录潜力增强。

染色质的可及性与组蛋白修饰密切相关，反映了增强子、启动子和染色质结合 TF 之间的物理相互作用网络，通过这个网络协同调节基因表达。研究人员推测 PHLPP1 可能对消除 Klf4 启动子上的许可组蛋白修饰以及抑制 Klf4 基因转录至关重要。结果发现，PHLPP1 缺陷导致巨噬细胞在稳态条件下，组蛋白 H3 在 Ser10 位点的磷酸化以及 H3 在 Lys9 和 Lys27 位点的乙酰化水平升高。有趣的是，IL - 4 处理诱导的组蛋白 H3K9ac 和 H3K27ac 修饰在 PHLPP1 缺陷的巨噬细胞中显著增强。ChIP 实验表明，PHLPP1 缺陷显著促进了 IL - 4 触发的 Klf4 基因转录启动子区域的 H3K27ac 和 H3K9ac 修饰。这些数据揭示了 PH<这些数据揭示了 phlpp1 通过调节选择性组蛋白乙酰化修饰，抑制 il - 4 介导的 klf4>

组蛋白的动态可逆乙酰化修饰由组蛋白乙酰转移酶（HATs）和 HDACs 介导，是主要的表观遗传调控机制。研究人员探究 PHLPP1 是否与 HATs 或 HDACs 成员相互作用来控制 KLF4 基因转录。用各种 HATs 的特异性抑制剂处理后，发现 p300 或通用控制非抑制 5（GCN5）的抑制剂能部分逆转 IL - 4 诱导的 Klf4 表达增强。然而，IP 实验表明 PHLPP1 不与 p300 或 GCN5 相互作用，PHLPP1 缺陷也不影响 p300 或 GCN5 在 IL - 4 刺激下向 Klf4 启动子的募集。这些数据表明，PHLPP1 不通过与 HATs（包括 p300 和 GCN5）相互作用来调节 KLF4 表达。

因此，研究人员推断 PHLPP1 可能与 HDACs 相互作用来调节 Klf4 基因表达。内源性 IP 实验发现，PHLPP1 选择性结合 HDAC8，而不结合其他 I 类 HDACs（HDAC1、HDAC2 和 HDAC3）或 HDAC4。在共转染 PHLPP1 和 HDAC8 质粒的 293T 细胞中，coIP 实验也证实了它们之间的相互作用。为了确定 PHLPP1 与 HDAC8 相互作用的结构域，研究人员构建了多个 PHLPP1 截短突变体，包括缺失 PP2C 磷酸酶结构域、PDZ 结合结构域、PH 结构域和 LRR 结构域的突变体。coIP 实验发现，缺失 PP2C 结构域的 PHLPP1 突变体不能结合 HDAC8，而野生型 PHLPP1 和其他突变体能与 HDAC8 相互作用。此外，IL - 4 刺激后，野生型 BMDMs 中 HDAC8 向 Klf4 基因启动子的募集增加，而在 PHLPP1 缺陷的 BMDMs 中显著受损。

由于在促纤维化巨噬细胞中证实了 PHLPP1 与 HDAC8 的相互作用，研究人员进一步探究 PHLPP1 在巨噬细胞表型转变中的作用是否依赖于 HDAC8。沉默 HDAC8 消除了 PHLPP1 缺陷介导的 KLF4 转录增强，同时促进了 Klf4 启动子上的组蛋白乙酰化修饰（H3K27ac 和 H3K9ac），这与 PHLPP1 缺陷在巨噬细胞中的作用相似。最后，沉默 HDAC8 消除了 PHLPP1 缺陷介导的 IL - 4 诱导的 M2 基因启动子上 KLF4 富集差异，以及基因表达和 M2 巨噬细胞频率的差异。这些数据表明，在肺纤维化过程中，PHLPP1 通过其 PP2C 磷酸酶结构域募集 HDAC8，介导 Klf4 启动子上组蛋白乙酰化的消除，控制巨噬细胞向促纤维化表型的转变。
6. PHLPP1 对 HDAC8 在 Ser39 位点的去磷酸化决定其去乙酰化酶活性
HDAC8 参与多种癌症进展和非癌症疾病的发生发展，如 Cornelia de Lange 综合征（CdLS）、感染性疾病、心血管疾病等。已有研究表明，HDAC8 的多个点突变与上述疾病的发生发展密切相关，其中，由环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶 A（PKA）介导的 HDAC8 磷酸化控制其去乙酰化酶活性，导致组蛋白 H3 和 H4 的高乙酰化。

研究人员探究 PHLPP1 介导的蛋白去磷酸化是否影响 HDAC8 的去乙酰化酶活性和染色质结合能力。结果发现，在野生型 BMDMs 中，IL - 4 处理后 HDAC8 的 Thr 和 Ser 残基磷酸化水平均升高，而 PHLPP1 缺陷导致 HDAC8 的 Ser 磷酸化选择性增强，这表明 HDAC8 可能是 PHLPP1 的磷酸酶底物。先前的研究表明，HDAC8 的 Ser39 位点可被 PKA 磷酸化修饰。Ser39 位于 HDAC8 组蛋白去乙酰化结构域的第二个螺旋二级结构中，在多种哺乳动物（包括人和小鼠）中高度保守。蛋白质组学分析暗示 Ser43 和 Ser63 也可能是 HDAC8 蛋白的潜在磷酸化位点。突变 S39A 消除了 IL - 4 诱导的巨噬细胞中 HDAC8 的总 Ser 磷酸化，而 S43A 或 S63A 突变则没有这种效果。用特异性抗 Ser39 磷酸化抗体进行的免疫印迹实验表明，S39A 突变消除了巨噬细胞中 HDAC8 在有无 IL - 4 处理下的 Ser39 磷酸化，这表明 Ser39 是替代激活巨噬细胞中 HDAC8 的关键磷酸化位点。IL - 4 处理的 BMDMs 中 PKA 表达不变，但 PKA 活性增加。值得注意的是，PKA 抑制剂显著抑制了巨噬细胞中 HDAC8 的 Ser39 磷酸化，这表明 IL - 4 诱导的 HDAC8 在 Ser39 位点的磷酸化是由 PKA 介导的。

接下来，研究人员探究 PHLPP1 是否是负责 HDAC8 在 Ser39 位点去磷酸化的直接磷酸酶。结果发现，PHLPP1 缺陷不影响巨噬细胞中 HDAC8 的蛋白水平，无论是在 IL - 4 刺激下还是未刺激状态。有趣的是，IL - 4 处理诱导了 HDAC8 的 Ser39 磷酸化，而 PHLPP1 缺陷进一步增强了这种磷酸化。免疫荧光实验观察到，在 BLM 处理的 Phlpp1 - cKO 和 WT 小鼠的肺 F4/80⁺巨噬细胞中，虽然 PHLPP1 不影响 HDAC8 蛋白表达，但 Phlpp1 - cKO 小鼠肺组织中 HDAC8 Ser39 磷酸化阳性的 AMs 显著增加，这在分离的 BLM 处理小鼠的 AMs 中通过免疫印迹实验也得到了证实。此外，体外去磷酸化实验表明，存在 PHLPP1 时，HDAC8 在 Ser39 位点的磷酸化水平显著降低。这些数据表明，在 IL - 4 处理或肺纤维化过程中，PHLPP1 是巨噬细胞中 HDAC8 的磷酸酶。

由于先前的研究表明，Ser39 磷酸化负向影响 HDAC8 的去乙酰化酶活性，研究人员进一步探究 PHLPP1 介导的 HDAC8 去磷酸化对其去乙酰化酶活性的影响。结果发现，PHLPP1 缺陷显著降低了 IL - 4 处理的巨噬细胞中 HDAC8 的去乙酰化酶活性。与野生型 HDAC8 相比，S39A 突变导致去乙酰化酶活性显著增加。此外，S39A 突变促进了 HDAC8 向 Klf4 启动子的募集，从而降低了该区域的 H3K27ac 和 H3K9ac 修饰。这些 HDAC8 募集和去乙酰化酶活性的变化导致了 KLF4 蛋白的抑制以及随后 KLF4 介导的 M2 基因表达的抑制。这些数据表明，PHLPP1 通过调节 HDAC8 在 Ser39 位点的磷酸化，在控制 HDAC8 去乙酰化酶活性中发挥重要作用。
7. 抑制 KLF4 改善 PHLPP1 缺陷小鼠的肺纤维化和损伤
为了评估 PHLPP1 介导的 KLF4 抑制在预防 AMs 依赖的肺纤维化中的功能重要性，研究人员通过气管内注射携带 Klf4 - shRNA 的腺相关病毒 6（AAV6），在 Phlpp1 - cKO 和 WT 小鼠的 BLM 模型中沉默 KLF4 的表达。首先，研究人员从 BLM 处理的 Phlpp1 - cKO 小鼠中分离出原代肺成纤维细胞、AT2 细胞和 AMs，结果显示 AAV6 - shKlf4 处理显著降低了 AMs 中 Klf4 的表达，而对其他两种细胞类型的影响较小。此外，AAV6 - shKlf4 给药有效地沉默了 Phlpp1 - cKO 和 WT AMs 中 KLF4 的蛋白表达。

AAV6 - shKlf4 给药显著减轻了 BLM 诱导的 Phlpp1 - cKO 和 WT 小鼠的肺纤维化和损伤，组织病理学分析和 Ashcroft 评分表明，两种小鼠的肺纤维化程度相似且明显减轻。一致地，接受 AAV6 - shKlf4 处理的 Phlpp1 - cKO 和 WT 小鼠肺组织中的胶原蛋白水平降低，纤维化蛋白（I 型胶原和 α - SMA）的表达也显著减少。KLF4 沉默还逆转了 Phlpp1 - cKO 小鼠 BLM 模型肺组织中 Arg1 蛋白水平的升高，以及分离的 AMs 中其他 M2 标记基因（包括 Arg1、Retnla、Mrc1 和 Tgfb1）表达水平的上调。

为了进一步明确 AAV6 - shKlf4 对肺纤维化的治疗效果是否依赖于 AMs，研究人员在巨噬细胞耗竭的 Phlpp1 - cKO 肺纤维化小鼠中进行 AAV6 - shKlf4 气管内给药。结果显示，在没有巨噬细胞的情况下，AAV6 - shKlf4 对改善肺纤维化的作用很小。这些体内研究突出了 PHLPP1 介导的 KLF4 转录抑制在控制 AMs 介导的肺纤维化中的功能重要性，为肺纤维化提供了一种潜在的治疗方法。

讨论

多项研究表明，PHLPP1 是宿主稳态的重要调节因子，其功能障碍或突变会导致胚胎发育异常，甚至促进多种疾病的发生发展，包括心血管、神经退行性和代谢性疾病等。然而，PHLPP1 在呼吸系统疾病，尤其是 IPF 中的作用仍不明确。本研究揭示了 PHLPP1 在 AMs 介导的肺纤维化中的保护功能。PHLPP1 通过巨噬细胞表观遗传重编程，控制肺损伤时 ECM 和胶原的积累以及随后的组织纤维化，为 IPF 的病因和发病机制提供了新的见解，并为 IPF 的治疗提供了特定的策略。

虽然 PHLPP1 最初在肿瘤生物学中被认为是 AKT 的磷酸酶，但在不同细胞类型的不同生理和病理条件下，已发现了更多 PHLPP1 的底物。在本研究中，研究人员发现纤维化肺组织的 AMs 细胞核中存在 PHLPP1，它通过使组蛋白乙酰化酶 HDAC8 去磷酸化，介导促纤维化反应的表观遗传重编程。PHLPP1 缺陷导致 HDAC8 的 Ser39 位点过度磷酸化，重塑了表观遗传景观，驱动了 AMs 中纤维化基因的转录。

KLF4 被广泛认为是 AMs 的关键 TF，其表达和活性受 IL - 4 刺激调节。在组织修复和纤维化过程中，KLF4 与 STAT6 合作诱导 M2 遗传程序。本研究发现，HDAC8 和 PHLPP1 的相互作用通过调节 AMs 中的 H3K9ac 和 H3K27ac 修饰，表观遗传沉默 KLF4 的表达，从而阻碍了肺纤维化过程中致病性 AMs 依赖的肺成纤维细胞激活。因此，在肺纤维化模型小鼠中给予 Klf4 - shRNA AAV6 可以恢复 PHLPP1 缺陷的影响，有效改善组织损伤和肺功能障碍。

总之，本研究结果突出了 PHLPP1 是 AMs 中促纤维化反应的关键调节因子。在肺纤维化条件下，PHLPP1 特异性受到抑制，导致 HDAC8 在 Ser39 位点的过度磷酸化，以及 Klf4 基因位点的组蛋白乙酰化和染色质可及性增强。PHLPP1 缺陷介导的 KLF4 过表达促进了 AMs 的促纤维化激活和纤维化基因表达，最终导致不受控制的促纤维化病理反应和疾病进展。

研究局限性

本研究表明 AMs 中 PHLPP1 缺陷会加剧肺纤维化，但仍存在一些局限性。首先，Phlpp1 表达降低的机制需要进一步阐明。其次，在特定小鼠模型中对 PHLPP1 和 KLF4 之间机制关系的研究，可能限制了研究结果对人类肺纤维化的适用性，因为人类疾病的机制更为复杂。专注于 PHLPP1 和 KLF4 的简化研究方法，可能无法全面捕捉 AMs 中复杂的表观遗传景观。因此，尽管本研究强调了 PHLPP1 在肺纤维化中的关键作用，但进一步的研究对于解决这些局限性，深入了解包括 IPF 在内的肺部疾病中表观遗传重编程的复杂性至关重要。