利用 FlyVISTA 平台深度剖析果蝇睡眠行为的创新研究

本文介绍 FlyVISTA 平台，它能对果蝇睡眠进行深度表型分析，揭示睡眠相关微行为。

　　

一、引言

睡眠在可塑性、学习记忆、新陈代谢、免疫反应和神经元健康等方面起着关键作用。研究简单的遗传可操控非哺乳动物的睡眠，有助于深入理解睡眠的分子和细胞过程，揭示跨物种保守的睡眠特征。

目前果蝇睡眠表型分析方法多依赖简单的运动静止测量，存在局限性。为深入研究果蝇睡眠及相关微行为，研究团队开发了 FlyVISTA（Fly Video Imaging System with Tracking and Analysis）机器学习平台，该平台集成高分辨率视频成像系统、深度学习网络和计算流程，可对自由移动果蝇的微行为进行表征和量化。

二、研究结果

1. 高分辨率视频成像与静止微行为注释：为克服传统方法的不足，研究人员设计了 FlyVISTA 系统。该系统采用侧视成像，让果蝇在定制的 3D 打印小室中自由活动，成像分辨率比以往研究提高约 40 倍，能清晰观察和标注果蝇的 35 个身体部位。通过训练 DeepLabCut 模型标注身体部位，并生成 “特征” 量化身体部位间的相对运动。在长时间静止期间，观察到果蝇存在姿势放松、触角下垂、节律性舐吸（proboscis extension，PE）和平衡棒切换（haltere switch，HS）等微行为，还发现腿部的细微快速节律运动，这些微行为丰富了对果蝇睡眠行为的认识。
2. 闭环觉醒阈值分析：睡眠的一个关键特征是觉醒阈值升高。研究人员使用 1064 - nm 红外激光在闭环系统中对果蝇进行加热，以量化觉醒阈值。实验发现，觉醒阈值与果蝇静止时间呈弱正相关，且在夜间呈现动态变化，前半夜较高，后半夜逐渐降低。此外，研究表明果蝇的睡眠周期可能短于 5 分钟，≥3 分钟的行为静止（无运动、梳理、进食或排便）与睡眠相关。通过该系统还观察到，果蝇在觉醒前会出现特定微行为的逆转，如 HS 和触角的 “向上” 运动，这暗示 HS 与更深的睡眠阶段相关，且微妙的觉醒刺激可揭示不同的睡眠亚状态。
3. 加波沙朵（gaboxadol）处理后的微行为和睡眠：GABA_A激动剂加波沙朵可促进果蝇睡眠并触发 PE。研究人员用 FlyVISTA 系统研究加波沙朵处理果蝇后的微行为变化。结果显示，加波沙朵处理后，果蝇的进食行为减少，梳理和 PE 行为增加，随后出现微运动，约 1 小时后睡眠行为显著增加，但睡眠常伴有运动控制受损的特征。此外，对照组果蝇有大量 “反流 / 冒泡” 微行为，而加波沙朵处理组未观察到该现象。
4. 不同背扇形体（dorsal fan-shaped body，dFB）驱动线的光遗传学激活：研究人员利用 FlyVISTA 平台对 dFB 神经元进行光遗传学激活实验，以研究其对睡眠的影响。实验发现，常用的 R23E10 - Gal4 驱动线激活后，果蝇虽停止大的运动，但出现频繁微运动和梳理行为，并不诱导睡眠。而 SS54320 - split - Gal4 驱动线在 10Hz（50% 占空比）光遗传学激活后，果蝇睡眠行为显著增加，SS55832 驱动线激活则对睡眠无明显影响。此外，研究人员还对 R5 神经元进行光遗传学激活，发现不同的 R5 神经元驱动线激活后的表型存在差异，这可能与细胞类型或驱动线强度有关。
5. FlyVISTA 的自动行为分类：从视频数据注释中提取有意义的行为是计算行为学的一大挑战，尤其是分析与睡眠相关的微行为。FlyVISTA 的计算流程通过特征提取、半监督行为嵌入和行为类别委员会分类三个步骤，对未注释的果蝇视频进行行为分类。经留一法交叉验证，该流程在分类 PE 和腿部调整行为方面表现出色，分类梳理和进食行为的效果稍差，分类 HS 行为相对较难，但总体上能有效分类果蝇的觉醒和睡眠相关微行为。
6. 果蝇睡眠的量化：利用 FlyVISTA 对自由移动果蝇的睡眠进行量化分析，发现自由移动果蝇的睡眠相对集中，与固定、束缚果蝇的高度碎片化睡眠不同。雌性果蝇夜间睡眠量稳定，雄性果蝇则在深夜睡眠量急剧减少。白天，雌雄果蝇在黄昏附近睡眠减少。此外，睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）后，果蝇的睡眠量和睡眠周期均显著增加。与传统的果蝇活动监测器（Drosophila Activity Monitors，DAM）相比，FlyVISTA 测量的睡眠量和睡眠巩固情况更准确，DAM 单光束监测器倾向于高估睡眠量和巩固程度，多光束监测器则倾向于低估。
7. PE 行为动态：研究发现，自由移动果蝇的 PE 事件在夜间睡眠周期中出现的频率并非单调下降，而是在夜间早期和中期出现峰值。PE 事件的间隔（inter - PE interval，IPI）约为 3s，但存在一定差异。大部分 PE 事件发生在睡眠周期中，SD 会导致 PE 计数显著增加，PE 每周期的数量减少，IPI 缩短，表明 PE 通常在睡眠中发生，并受稳态驱动调节。
8. HS 行为作为深度睡眠的标记：HS 事件在夜间和白天的睡眠周期中均有出现，且在夜间午夜时出现峰值。HS 事件与睡眠密切相关，且在睡眠周期中出现的时间相对较早。睡眠周期中出现 HS 的果蝇，其觉醒阈值更高，睡眠周期更长，表明 HS “向下” 微行为标志着更深的睡眠阶段。此外，HS 行为还存在多种亚型，如微觉醒事件、连续的 HS 事件和 “平衡棒振荡” 事件，这些事件可能反映了果蝇不同的睡眠状态。

三、讨论

果蝇是研究睡眠的常用非哺乳动物模型，传统上多采用≥5 分钟的行为静止来定义睡眠，该方法虽简单有效，但存在局限性。FlyVISTA 平台的出现，为果蝇睡眠研究带来新的视角。

利用 FlyVISTA，研究人员发现果蝇可在相对较短（≥3 分钟）的静止周期中睡眠；自由移动果蝇的 PE 事件频率低于束缚果蝇，部分原因可能是束缚会增加果蝇的代谢需求；还观察到果蝇睡眠中的多种振荡身体运动，如腿部的快速节律运动和平衡棒的振荡运动，这些运动反映了果蝇不同的生理状态。

此外，HS 行为作为一种新发现的仅在静止期间出现的微行为，可作为果蝇深度睡眠的标记，这一发现进一步支持了果蝇存在多个睡眠阶段的观点。不过，要全面表征果蝇的不同睡眠阶段，还需对自由移动动物的大脑和肌肉进行神经生理学成像。

FlyVISTA 平台也存在一些局限性，如通量较低、成本较高、多日记录存在挑战等。但它能够对自由移动果蝇的睡眠和相关微行为进行自动化、高分辨率分析，且可用于量化果蝇的任何行为，挖掘未描述的行为，为果蝇神经科学家提供了有力的研究工具。随着技术的发展，类似 FlyVISTA 的应用有望深入揭示动物如何整合内部状态和外部感知以产生行为。