UBE3D 基因缺陷如何影响小鼠胚胎发育：关键机制与潜在意义

为探究 UBE3D 在胚胎发育中的作用，研究人员构建 Ube3d 敲除小鼠，发现其影响 Homeobox 基因，意义重大。

　　在生命的奇妙旅程中，胚胎发育是至关重要的起始阶段。其中，神经胚形成（Neurulation）是脊椎动物早期胚胎发育的关键事件，这一过程要是出了问题，可能会导致胚胎死亡或者先天性疾病，比如神经管缺陷。在众多影响胚胎发育的因素中，Homeobox 基因扮演着极其重要的角色。它含有高度保守的 Homeobox 结构域，作为转录因子调控细胞命运的决定。在脊椎动物里，大约有 250 - 300 种蛋白质由 Homeobox 基因编码，这些蛋白质依据 DNA 结合结构域和蛋白质 - 蛋白质相互作用结构域，可分为 HOX、ANTP 等不同亚组。经典的 HOX 基因在人类和小鼠中都有 39 个，它们被分为四个旁系同源簇（HOXA 到 HOXD），其在胚胎中的表达遵循时空共线性，对胚胎发育起着关键作用。

而 UBE3D（泛素蛋白连接酶 E3D，Ubiquitin protein ligase E3D）此前被发现与细胞周期蛋白 B 的泛素化、前列腺癌细胞中 3βHSD1 的泛素化等有关，还被确定为与年龄相关性黄斑变性相关的重要蛋白质。但令人疑惑的是，它在胚胎发育过程中的具体功能一直是个谜。为了揭开这个谜团，来自复旦大学的研究人员展开了深入研究。这项研究成果发表在《Cell Death Discovery》杂志上，为我们理解胚胎发育机制提供了新的视角。

研究人员为了深入探究 UBE3D 在胚胎发育中的作用，主要运用了以下几种关键技术方法：首先，利用 CRISPR/Cas9 技术构建 Ube3d 基因敲除小鼠模型，这是研究基因功能的重要手段；其次，通过 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达的变化，全面了解基因在不同条件下的表达情况；此外，还运用了免疫荧光染色和原位杂交技术，用于观察基因的表达模式和定位。

研究结果如下：

1. Ube3d^-/-小鼠在 E8.5 - E11.5 期间表现出显著的发育延迟和畸形：研究人员通过 CRISPR/Cas9 技术删除 Ube3d 基因的外显子 2 构建了 Ube3d 敲除小鼠。实验结果显示，Ube3d^{+/ -}小鼠能够存活且外观正常，但 Ube3d^-/-小鼠在胚胎发育过程中出现了严重问题。在 E8.5 时，Ube3d^-/-胚胎的大小明显小于野生型（Ube3d^+/+）和杂合子（Ube3d^{+/ -}）胚胎，心脏管也不可见。到了 E9.5，Ube3d^-/-胚胎发育延迟和畸形更加严重，出现了头部小、神经管未闭合、心脏发育不全等症状。E10.5 时，这些症状进一步加剧，还出现了心脏环化不完全、心包肿胀、脑泡发育不全等问题，并且肢体芽不可见。E11.5 时，大多数 Ube3d^-/-胚胎已经死亡，存活的胚胎也存在严重的形态异常。这一系列结果表明，Ube3d 在小鼠神经胚形成和形态发生中起着至关重要的作用。
2. UBE3D 在 E9.5 - E11.5 小鼠中的表达模式：通过原位杂交和免疫荧光实验，研究人员发现 UBE3D 在 E9.0 时，在神经管中能检测到中等信号；E9.5 - E10.5 时，在神经管、视坑、心脏和肢芽中信号较强；E11.5 时，在前脑和肢芽中信号较高。而且，在 E9.5 - E10.5 野生型胚胎的神经管中，UBE3D 信号明显，但在 E9.5 的 Ube3d^-/-胚胎中则检测不到该信号。这种表达模式与 Ube3d^-/-胚胎的表型是一致的。
3. Ube3d^-/-小鼠在 E10.5 时多个 Homeobox 基因下调：研究人员对 E10.5 的胚胎进行 RNA 测序，发现 Ube3d^-/-胚胎与野生型胚胎之间有 710 个差异表达基因（DEGs）。通过对这些差异表达基因进行 GO 富集分析，发现主要涉及心血管发育、中枢神经系统发育等多个与胚胎发育相关的途径。进一步分析发现，在 Ube3d^-/-小鼠中，下调基因里 Homeobox 基因的比例特别高。通过 qRT-PCR 实验也证实，在 E10.5 的 Ube3d^-/-胚胎中，11 个下调的 Homeobox 基因中有 10 个表达显著降低。这些基因包括 Hoxa5、Hoxa9 等多个 Hox 基因，以及 Emx2、Lhx2 等，它们对小鼠胚胎发育阶段的形态发生至关重要。
4. UBE3D 缺乏会损害 CPSF3，且 UBE3D 会降低 CPSF3 的多聚泛素化水平：研究人员通过酵母双杂交筛选和数据库搜索，发现 CPSF3（切割和多聚腺苷酸化特异性因子 3，cleavage and polyadenylation specific factor 3）是 UBE3D 的潜在靶点。实验表明，UBE3D 缺乏会导致 CPSF3 蛋白水平降低，但不影响其 mRNA 表达。在体内和体外实验中都证实，UBE3D 能够稳定 CPSF3 蛋白。进一步研究发现，UBE3D 可能作为一种去泛素化酶，使 CPSF3 的多聚泛素化水平降低。构建的 UBE3D 突变体实验显示，尽管突变体仍能与 CPSF3 相互作用，但失去了对 CPSF3 的去泛素化功能。
5. CPSF3 的显性负突变体部分降低了几个 Homeobox 基因的 mRNA 水平：由于无法通过 RNAi 敲低 HEK 293T 细胞中内源性 CPSF3 的表达，研究人员构建了 CPSF3 的显性负突变体 CPSF3-SM（单突变，H73A）和 CPSF3-DM（双突变，D75K/H76A）。实验发现，过表达这些突变体后，除 MNX1 和 NKX2 - 5 外，其他几个 Homeobox 基因的 mRNA 水平显著降低，表明 CPSF3 的功能异常会影响 Homeobox 基因的表达。

研究结论与讨论：
这项研究通过构建 Ube3d 敲除小鼠模型，深入探究了 UBE3D 在小鼠胚胎发育中的作用机制。研究发现，UBE3D 基因缺陷会导致小鼠胚胎严重生长迟缓、畸形，尤其在大脑、神经管、心脏和肢芽等部位，最终导致胚胎在 E10.5 - E11.5 死亡。UBE3D 的缺乏会显著降低多个 Homeobox 基因的表达，这些基因在胚胎的前后轴体节形成、器官发生等过程中起着关键作用。同时，研究还揭示了 UBE3D 通过与 CPSF3 相互作用，稳定 CPSF3 蛋白，影响 Homeobox 基因的表达。然而，该研究也存在一些局限性，比如只研究了 E8.5 - E11.5 的胚胎，未涉及更早阶段；而且 UBE3D 的功能可能更为复杂，其对其他基因的影响以及 CPSF3 对 Homeobox 基因的调控机制还需要进一步研究。尽管如此，这项研究依然为我们理解胚胎发育过程中基因的调控机制提供了重要线索，为后续相关研究奠定了基础，对深入探索生命早期发育的奥秘有着重要意义。