TBK1 基因缺陷如何影响运动神经元？斑马鱼模型给出新线索

为探究 TBK1 基因功能及与 ALS 关系，研究人员构建斑马鱼模型，发现其影响运动神经元，为 ALS 研究提供新思路。

　　在神秘的生命科学领域，肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）一直是研究者们试图攻克的难题。这是一种致命的神经退行性疾病，患者的运动神经元会逐渐丧失功能，就像身体的 “控制开关” 一个个失灵，导致进行性瘫痪，生命也随之走向终结。大约 10% 的 ALS 患者存在遗传风险因素，其中 TBK1（TANK-binding kinase 1）基因的单等位基因功能丧失突变，在家族性 ALS 和额颞叶痴呆（FTD）患者中显著富集，被认为是引发 ALS 的重要原因之一。

TBK1 基因参与多种细胞过程，如先天免疫、自噬和细胞程序性死亡。但在 ALS 发病机制中，TBK1 基因功能缺失影响的众多途径尚未完全明确，且缺乏合适的体内模型来深入探究。为了填补这些空白，来自法国 Imagine Institute 等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究，相关成果发表在《Cell Death Discovery》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。在构建斑马鱼模型时，利用 CRISPR-Cas9 技术对 tbk1 基因进行编辑，制造基因缺失突变体；同时使用反义吗啉代寡核苷酸（AMO）敲低 tbk1 基因的表达。通过代谢组学和蛋白质组学分析，研究 tbk1 基因缺陷对斑马鱼代谢和蛋白质表达的影响。还对人诱导多能干细胞（iPSC）来源的运动神经元进行研究，与斑马鱼模型的结果相互验证。

下面来看看具体的研究结果：

• Morpholino 诱导的 tbk1 敲低导致早期运动功能下降：研究人员在斑马鱼胚胎的单细胞阶段注射靶向 tbk1 起始密码子的 AMO，成功敲低 tbk1 基因表达。48 小时胚胎期（hpf）时，tbk1 表达量减少超过 40%。通过触摸诱发逃逸反应（TEER）测试发现，tbk1 敲低的斑马鱼幼虫游泳能力显著下降，运动神经元数量也明显减少，且这种影响在 32 hpf 时就已出现，但肌肉纤维长度无明显变化，表明 tbk1 敲低主要影响运动神经元的发育或存活，而非肌肉本身。
• CRISPR-Cas9 诱导的 tbk1 缺失导致斑马鱼幼虫运动缺陷和早期致死：研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术，设计靶向 tbk1 基因外显子 1、2 和 4、5 的串联单导向 RNA（sgRNA），成功在斑马鱼中诱导出 tbk1 基因的大片段缺失，且突变效率约为 70%。tbk1 基因缺失对斑马鱼幼体的总体发育无显著影响，但从 5 日龄（dpf）开始，突变体幼虫的运动功能出现缺陷，自发游泳距离减少。从 9 dpf 开始，死亡率显著增加，至 13 dpf 时死亡率高达 90%，这表明 tbk1 基因在斑马鱼幼体发育中起着关键作用 。
• tbk1 突变斑马鱼的烟酰胺代谢受损：鉴于 TBK1 基因缺失的多效性和运动神经元缺陷相关的代谢改变，研究人员对 6 dpf 的 tbk1 突变斑马鱼进行代谢组学分析。结果发现，烟酰胺（NAM）、喹啉酸（QA）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）等代谢物水平发生显著变化，烟酰胺和喹啉酸水平升高，NAD⁺水平降低，烟酰胺代谢途径明显失调。用 NAD⁺前体烟酰胺核糖（NR）处理 tbk1 突变幼虫后，其 6 dpf 时的自由游泳能力得到显著挽救，但存活率未得到改善。
• tbk1 缺失导致斑马鱼的坏死性凋亡增加：对 8 dpf 的 tbk1 缺陷幼虫进行蛋白质组学分析，发现多个与先天免疫相关的通路以及细胞凋亡和坏死性凋亡相关基因显著失调。tbk1 突变斑马鱼中，CASP8 和 RIPK1 等坏死性凋亡相关基因表达上调，通过 TUNEL 染色也观察到 tbk1 缺陷斑马鱼后脑的凋亡细胞数量增加 。用坏死性凋亡抑制剂 necrosulfonamide（NSA）处理突变幼虫后，其存活率得到显著提高。
• tbk1 突变斑马鱼和 ALS 患者 iPSC 来源的运动神经元中，与 ALS 通路相关的蛋白质表达受到影响：研究人员对携带 TBK1 功能缺失突变的 ALS 患者 iPSC 来源的运动神经元进行蛋白质组学分析，并与 tbk1 突变斑马鱼的结果进行比较。发现两者共有 260 种共同失调的蛋白质，这些蛋白质主要富集在与神经退行性过程相关的通路中，包括 KEGG ALS 通路。其中，参与核质转运的 GLE1、NDC1、NUP107、NUP155 和 SRSF3 等基因在两种模型中均上调。同时，在 tbk1 突变斑马鱼和患者 iPSC 来源的运动神经元中，坏死性凋亡相关蛋白均显著富集，STAT1 表达上调。

综合上述研究，该研究通过构建 tbk1 基因缺陷的斑马鱼模型，发现 tbk1 基因对维持运动神经元功能至关重要。tbk1 基因表达下调会影响运动神经元的活力和运动反应，基因缺失则导致斑马鱼幼体严重表型和存活率降低。研究还揭示了烟酰胺代谢和坏死性凋亡通路在 tbk1 缺陷病理中的关键作用，为理解 ALS 发病机制提供了新视角。此外，对 ALS 患者 iPSC 来源运动神经元的研究，进一步验证了斑马鱼模型的研究结果，凸显了该模型在未来 ALS 研究和药物筛选中的重要价值。不过，该研究也存在一定局限性，如使用斑马鱼幼体作为模型，可能会削弱研究结果的临床相关性。但斑马鱼模型在研究疾病早期阶段仍具有独特优势，未来研究可进一步探索 TBK1 基因功能缺失影响的具体机制，以及如何通过调节相关通路来开发治疗 ALS 和其他神经肌肉疾病的新方法。