发现 DNase TREX1 与膜内蛋白酶 SPP 的关联：解锁疾病发病机制新密码

研究人员针对 TREX1 相关疾病机制开展研究，发现 TREX1 是 SPP 的底物，其切割受疾病相关变体影响。

　　在生命科学的微观世界里，细胞如同一个个精密的 “小宇宙”，其中的各种蛋白质和分子相互协作，维持着生命的正常运转。然而，当这些 “小宇宙” 中的平衡被打破时，疾病便可能悄然降临。在众多与细胞内分子相关的疾病研究中，TREX1（Three prime repair exonuclease 1，3'- 修复核酸外切酶 1）与一些自身免疫和炎症性疾病的关联备受关注。TREX1 具有 3'^-5' 核酸外切酶活性，能够降解进入细胞质的 DNA，在正常情况下，它如同一位忠诚的 “卫士”，守护着细胞内的环境稳定。但当 TREX1 出现功能缺失变异时，就会引发如 Aicardi-Goutières 综合征（AGS）这样严重的神经炎症性脑病，患者会出现 I 型干扰素过度产生的情况，进而导致免疫细胞激活和炎症性器官损伤。此外，TREX1 的一些变异还与系统性红斑狼疮（SLE）等疾病相关。

目前，虽然知道 TREX1 变异与这些疾病有关，但其中的具体机制却并不完全清楚。比如，一些影响 TREX1 跨膜段的变异，距离其催化位点很远，人们并不明白这些突变是如何影响 TREX1 的功能并导致疾病发生的。为了深入探究这些问题，来自德国德累斯顿工业大学、美国贝勒医学院等机构的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》上。

研究人员在研究中主要运用了基因编辑技术、细胞系实验以及蛋白质印迹法等关键技术方法。研究人员通过 CRISPR/Cas9 技术构建了 SPP 缺陷的 HEK 细胞系；利用多种细胞系，包括 HeLa、HEK293T 等进行实验；通过蛋白质印迹法来检测蛋白质的表达和加工情况。

研究结果如下：

1. TREX1 是 SPP 的底物：TREX1 作为内质网驻留的尾锚定蛋白，与 SPP 在 HeLa 细胞中共定位。在蛋白酶 - 底物共表达实验中，野生型 SPP 能够降低 TREX1 的总水平，而催化失活的 SPP D265A 突变体则没有这种作用。研究人员构建了 C 末端带有 HA 标签的 TREX1 融合蛋白，进一步证实了 SPP 对 TREX1 的切割作用。时间进程实验表明，随着 SPP 的诱导表达，TREX1 前体逐渐转变为 N 末端切割产物。此外，通过交换 TREX1 跨膜结构域和非 SPP 底物 HO2 的跨膜结构域，发现 TREX1 跨膜结构域包含被 SPP 切割的关键决定因素。通过蔗糖密度梯度离心实验，证明了 SPP 切割 TREX1 后，其切割片段会释放到细胞质中。
2. 内源性 TREX1 可被 SPP 切割：在 HEK 细胞中转染 TREX1-HA 后，检测到一个可能代表切割片段的微弱条带，该条带可被 SPP 的药物抑制剂 X 减弱，同时 TREX1 的整体丰度增加。在 SPP 缺陷的 HEK 细胞中，该切割片段减少，总细胞 TREX1 水平增加。在 HeLa 细胞和单核细胞 THP-1 细胞中，抑制 SPP 也导致 TREX1 的条带发生位移，并且在 THP-1 细胞的细胞质中检测到内源性 TREX1。在人外周血单核细胞（PBMCs）中也证实了内源性 TREX1 的切割现象。这表明内源性 TREX1 可被 SPP 切割，产生可溶性细胞质 TREX1 并促进其降解。
3. SPP 和蛋白酶体系统共同影响 TREX1 的周转：使用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理表达 TREX1-HA 的 TR-HEK SPP 细胞，可明显稳定由 SPP 切割产生的可溶性 TREX1，同时也略微稳定全长前体。而使用氯化铵干扰溶酶体降解则对 TREX1 的两种形式没有明显影响。在 SPP 缺陷的 HEK 细胞和野生型 HEK 细胞中，硼替佐米处理均能显著增加 TREX1-HA 水平。通过环己酰亚胺阻断蛋白质合成实验发现，至少有两条降解途径控制全长 TREX1 的稳定性，其中 SPP 介导的膜内蛋白水解专门促进 TREX1 胞质结构域（ICD）的释放。
4. SLE 相关的 TREX1 跨膜结构域变异影响 SPP 的切割：研究人员研究了与 SLE 相关的 TREX1 跨膜结构域变异（P290L、Y305C、G306A）对 SPP 切割的影响。结果表明，P290L 变异使 TREX1 被 SPP 切割的效率降低；G306A 变异的切割动力学与野生型蛋白相似；Y305C 变异在无多西环素诱导时就出现明显的双条带，SPP 诱导后前体进一步减少，切割片段增加，且该变异的切割片段在细胞质中被检测到。虽然 Y305C 变异的切割不是由 SPP 介导的，但 SPP 似乎在其周转中起作用。此外，P290L 和 G306A 变异在 SPP 缺陷的细胞中也略微稳定，表明内源性 SPP 对它们有切割作用。与野生型相比，Y305C 和 G306A 变异的稳态丰度降低，而 P290L 变异的稳态丰度与野生型相似。
5. AGS 致病的 T303P 突变增强 SPP 介导的 TREX1 降解：研究人员描述了两名携带 TREX1 T303P 变异纯合子的 AGS 患者。在细胞实验中，TREX1 T303P 变异在未诱导细胞中就呈现双条带，随着 SPP 表达增加，前体进一步减少，切割片段富集。在 SPP 缺陷的细胞中，T303P 变异的切割片段消失，前体丰度大幅增加。免疫荧光和亚细胞分级实验表明，T303P 变异增强了 TREX1 被 SPP 切割的能力，使其持续释放到细胞质中，并且改变了 TREX1 的稳态丰度。在患者的原代成纤维细胞和 PBMCs 中，TREX1 蛋白几乎检测不到，抑制 SPP 能够略微稳定 TREX1 T303P 蛋白，但与野生型对照相比，恢复程度较低。

研究结论和讨论部分指出，该研究发现 TREX1 是 SPP 的新底物，这扩展了人们对 SPP 生理功能和 TREX1 病理生理学的认识。T303P 和 P290L 变异对 TREX1 可切割性的影响与目前对 SPP 蛋白水解的理解相符，即跨膜结构域中的螺旋不稳定残基会影响底物的可切割性。Y305C 变异的情况较为复杂，可能由除 SPP 外的其他蛋白酶切割。该研究还解释了 T303P 变异导致 AGS 的机制，即增强的 SPP 介导的 TREX1 周转导致功能丧失。此外，研究还发现 SPP 在 TREX1 降解中起重要作用，并且揭示了 TREX1 蛋白水解的生理病理相关性。这一研究成果为深入理解 TREX1 相关疾病的发病机制提供了新的视角，也为未来开发针对这些疾病的治疗策略提供了潜在的靶点和理论依据。