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为解决传统 CAR-T 疗法问题，研究人员开展 circRNA 构建 CAR-T 细胞治疗小细胞肺癌研究，证实其可行性及优势。
研究背景：小细胞肺癌治疗困境与 CAR-T 疗法的新希望
小细胞肺癌（SCLC）是一种侵袭性强、预后差的恶性肿瘤，目前的治疗手段有限，患者 5 年生存率较低，迫切需要创新的治疗方法。嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法在癌症治疗领域展现出了巨大的潜力，但传统基于病毒载体的 CAR-T 疗法存在诸多问题。其生产过程复杂，需要严格的 Good Manufacturing Practice（GMP）标准，涉及外周血白细胞分离、病毒载体介导的基因修饰等多个步骤，对技术和设备要求高，成本高昂，许多患者难以承受。而且，病毒载体将 CAR 基因整合到宿主 T 细胞基因组中，会导致 CAR 构建体永久表达，存在引发细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性等长期副作用的风险。
随着 RNA 技术的发展，环状 RNA（circRNA）逐渐进入人们的视野。circRNA 是一种共价闭合的单链 RNA 分子，与信使 RNA（mRNA）相比，具有更高的稳定性和更长的蛋白质表达时间。理论上，circRNA 可在体外大量合成并递送至受体细胞，用于多种疾病的治疗。在 CAR-T 细胞构建中，使用 circRNA 有望克服传统病毒载体的局限性，为 SCLC 的治疗带来新的希望。基于此，北京大学人民医院等机构的研究人员开展了相关研究，该研究成果发表在《Experimental Hematology & Oncology》上。
研究方法：关键技术助力 circRNA - CAR-T 细胞研究
研究人员主要采用了以下关键技术：
- 细胞培养技术：使用密度梯度离心法从健康供体的外周血中分离出外周血单个核细胞（PBMCs），并进一步纯化出 CD3+T 细胞进行培养。同时，培养多种细胞系，包括 DLL3 阳性的 SCLC 细胞系和正常肺支气管上皮细胞系等。
- RNA 合成技术：运用 Group I intron 自我剪接系统合成 circRNA，通过一系列复杂步骤构建包含目的基因的质粒，再经体外转录（IVT）等操作获得 circRNA，并进行纯化和质量检测。mRNA 的合成步骤与之类似，但在 IVT 反应中使用 N1 - 甲基假尿苷（m1Ψ）替代尿苷。
- CAR - T 细胞制备技术：利用 NeonTMNxT 电穿孔系统将 circRNA 转染到 T 细胞中，构建 circRNA - CAR-T 细胞，并优化电穿孔条件，确定最佳电压、circRNA 剂量等参数。
- 检测分析技术：运用多种检测技术评估细胞功能，如通过流式细胞术检测细胞表面标志物、CAR 表达等；使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子分泌水平；构建小鼠肿瘤模型，通过生物发光成像等方法监测肿瘤生长情况。
研究结果：circRNA - CAR-T 细胞展现强大抗癌实力
- circRNA 的优势特性验证：研究人员构建了编码增强绿色荧光蛋白（EGFP）和抗 DLL3 CAR 的 circRNA。经 RNase R 处理和 Sanger 测序验证了 circRNA 的闭环结构和正确的环化。与 mRNA 相比，circRNA 在稳定性、蛋白质表达持续时间和免疫原性方面表现更优。在体外实验中，circRNA 转染的细胞在 7 天内持续表达目标蛋白，而 mRNA 转染的细胞蛋白表达在第 1 天达到峰值后迅速下降。同时，HPLC 纯化后的 circRNA 免疫原性显著降低，与 m1Ψ mRNA 相当。
- 电穿孔条件优化：通过对不同电压和 circRNA 剂量的测试，确定了将 circRNA 转染到人类原代 T 细胞的最佳电穿孔条件为 1400V、5μg/million cells。在此条件下，circRNA - CAR-T 细胞的 CAR 表达更持久，且细胞活力不受影响。与 mRNA - CAR-T 细胞相比，circRNA - CAR-T 细胞所在组的 CD8+T 细胞和滤泡辅助性 T 细胞比例更高，调节性 T（Treg）细胞比例更低，表明 circRNA - CAR-T 细胞具有更强的细胞毒性和抗肿瘤活性。
- 体外细胞毒性实验：将 circRNA - CAR-T 细胞与 DLL3 阳性、GFP 标记的 SCLC 细胞系共培养，结果显示，circRNA - CAR-T 细胞在较低的效应细胞与靶细胞（ET）比例下，对肿瘤细胞的杀伤效率显著高于 mRNA - CAR-T 细胞。在 1:1 的 ET 比例下，circRNA - CAR-T 细胞的杀伤效率接近 60%。同时，circRNA - CAR-T 细胞分泌的关键效应细胞因子（TNF - α、IFN - γ 和 IL - 2）水平更高，激活的 CD69+和 CD25+T 细胞比例也更高。
- 体内抗肿瘤实验：在小鼠皮下肿瘤模型和肺原位肿瘤模型中，circRNA - CAR-T 细胞均展现出强大的抗肿瘤活性。在皮下肿瘤模型中，circRNA - CAR-T 细胞治疗组的肿瘤在第 21 天已无法检测到，所有小鼠存活；而 mRNA - CAR-T 细胞治疗组仅延迟了肿瘤生长，所有小鼠在第 33 天死亡 。在肺原位肿瘤模型中，circRNA - CAR-T 细胞治疗组的肿瘤生长抑制效果更显著，有两只小鼠的肿瘤细胞完全清除，且该组小鼠的生存率明显高于其他组。
研究结论与意义：开启 SCLC 治疗新篇章
本研究成功通过电穿孔将编码抗 DLL3 CAR 的 circRNA 导入人 T 细胞，构建了 circRNA - CAR-T 细胞，并在体外和体内实验中证实了其对 SCLC 细胞强大的靶向和杀伤能力。这一研究成果首次建立了 circRNA - 电穿孔平台构建 CAR-T 细胞的可行性，为 SCLC 的治疗提供了一种新的、更安全有效的策略。
虽然目前该研究存在一些局限性，如缺乏病毒构建的 CAR-T 组作为对照，实验模型不够生理相关，原位肿瘤模型小鼠数量有限等，但这依然是 SCLC 治疗领域的重要突破。未来研究可进一步优化 circRNA 设计，开发符合 GMP 标准的大规模生产方案，探索新的递送平台，并开展长期疗效和安全性研究。同时，将 circRNA - CAR-T 疗法与其他治疗方式联合，有望进一步提高治疗效果，为更多癌症患者带来希望。
