SubtiToolKit：革兰氏阳性菌基因工程的创新利器

为解决革兰氏阳性菌基因工程工具缺乏问题，研究人员开发 SubtiToolKit（STK），提升构建效率，意义重大。

　　在合成生物学蓬勃发展的当下，构建复杂的 DNA 结构成为该领域的核心任务。自 2008 年 Golden Gate（GG）方法问世后，多种克隆工具包应运而生，为不同生物的基因工程研究提供了有力支持，比如用于真核细胞工程的 MoClo、酵母工具包 Yeast Toolkit 以及针对大肠杆菌的 EcoFlex 等。然而，革兰氏阳性菌却在这场技术盛宴中被忽视，一直缺乏有效的遗传工具包。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为革兰氏阳性菌的模式生物，在分子生物学和生物产业中占据重要地位。它易于进行遗传操作，具备强大的蛋白质表达和分泌能力，并且被认定为安全（GRAS）的微生物。但由于缺乏合适的遗传工具包，其在生物工程领域的进一步发展受到限制。因此，开发适用于革兰氏阳性菌的遗传工具包迫在眉睫。

来自伦敦帝国理工学院（Department of Bioengineering, Imperial College London）、诺森比亚大学（Department of Applied Sciences, Northumbria University）等机构的研究人员，开展了针对革兰氏阳性菌遗传工具包的研究。他们成功开发出 SubtiToolKit（STK），这是一种高效的 GG 克隆工具包，专门用于枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性菌的基因工程操作。该研究成果发表在《TRENDS IN Biotechnology》上，为革兰氏阳性菌的生物工程研究开辟了新的道路。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先是 GG 克隆技术，利用 Type IIs 限制性内切酶在识别序列外切割 DNA，产生 4bp 的粘性末端，实现 DNA 片段的定向组装。其次，通过构建不同层次的载体，包括 pSTK level 0、1、2 和 pSTK - EXP 穿梭载体，实现了遗传部件的高效克隆和组装。此外，还运用了荧光蛋白标记技术、流式细胞术以及菌落 PCR 等技术，对构建的遗传部件和载体进行验证和分析。

研究结果

1. STK 的设计：STK 基于标准化的模块化和分层组装，采用独特的粘性末端语法，提高了组装效率。它包含两个系列的载体，pSTK level 0、1、2 用于在大肠杆菌中进行遗传部件和转录单元（TU）的克隆和组装，pSTK - EXP 穿梭载体则可在芽孢杆菌属、Geobacillus 属等革兰氏阳性菌中复制。STK 载体含有优化的 4bp 粘性末端，除用于连接核糖体结合位点（RBSs）和编码序列（CDS）的 TATG 粘性末端外，其他粘性末端可使组装疤痕最小化，减少对表达水平的影响。同时，不同层次的载体含有不同的抗生素抗性和筛选标记，便于筛选正确的组装产物。
2. 组装验证和克隆效率：在大肠杆菌中，研究人员通过构建表达 GFPmut3b 的 TU 和包含四个开放阅读框（ORFs）的操纵子，对 STK 的组装效率进行验证。结果显示，使用高效粘性末端时，10 个 GG 循环即可实现近 100% 的组装效率，产生数十个菌落。进一步研究发现，减少酶和 DNA 的用量会降低组装效率，当酶用量减少 50% 时，效率降至 86.5%，进一步稀释会导致效率急剧下降。
3. B. subtilis pEXP 穿梭载体验证和效率分析：pEXP 穿梭载体是 STK 用于 B. subtilis 转化的关键载体。研究人员构建了表达多种荧光蛋白的 pEXP level 1 载体和组装了胡萝卜素操纵子的 pEXP level 2 载体，并将其转化到 B. subtilis 中。结果表明，这些载体在 B. subtilis 中能够稳定存在，并且通过菌落 PCR 和颜色观察等方法证实了载体的完整性和功能。
4. 部件表征：STK 包含多种可诱导和组成型启动子、RBSs 和终止子。通过在 B. subtilis 中构建包含不同启动子、RBSs 和终止子的组装体，并使用 GFPmut3b 作为报告基因，研究人员对这些部件进行了全面表征。结果发现，不同启动子具有不同的转录强度和表达模式，可诱导启动子在不同诱导剂浓度下表现出多样的表达特性，组成型启动子中 3P 启动子表达水平最高，但也会对细胞生长产生一定影响。RBSs 在不同启动子下对翻译的调控作用不同，使用高表达启动子 P_hyperspan时，RBSs 能显著调节表达水平。终止子对蛋白质表达也有重要影响，部分终止子如 bkdB - cold - double - terminator 可通过稳定 mRNA 提高 GFPmut3b 的表达。
5. 组合组装：遗传工具包的优势之一是能够进行组合组装，产生大量不同的遗传构建体。研究人员利用 STK 进行组合组装，将不同的启动子、RBSs 和终止子与单个开放阅读框和骨架混合，在同一反应中产生所有可能的组合。通过转化大肠杆菌并筛选菌落，可获得所需的表达产物。为解决 B. subtilis 转化效率低的问题，研究人员采用高效转化方法和多制备技术，成功提高了转化效率，获得了不同荧光强度的菌落。
6. 基因组整合：基因组整合是基因工程中的重要操作。研究人员利用同源重组原理，设计了 STK 版本的 pMAD 载体用于 B. subtilis 的基因组整合。通过在 GG 反应中组装同源臂和目的基因，构建线性 DNA 组装体并转化 B. subtilis，获得了大量菌落，其中约一半菌落显示出正确的整合。该方法简化了整合遗传构建体的组装过程，提高了获得重组菌株的效率。
7. N - 和 C - 末端蛋白标签组装验证：蛋白质工程中，N - 和 C - 末端标签用于蛋白质纯化、分泌等多种应用。STK 允许将 0C - CDS 位置拆分为三个位置，用于分配标签。研究人员验证了 N - 末端分泌标签和 C - 末端标签的组装，发现 B. subtilis 分泌标签在大肠杆菌中具有毒性，为此设计了 “E. coli Expression Blocking Device”（EEBD）来解决这一问题。EEBD 在大肠杆菌中可阻止转录，避免毒性，转化到 B. subtilis 后可通过重组去除终止子，恢复基因表达，重组效率高达 85 - 90%。
8. STK - GeoBox for Geobacillus spp：Geobacillus 属和 Parageobacillus 属细菌是理想的微生物细胞工厂，但缺乏标准化的模块化和分层组装工具包。研究人员开发了 STK - GeoBox，包含兼容 STK 的载体和部件库。通过对启动子、终止子和分泌标签的表征，发现不同物种中相同部件的行为存在差异。例如，在不同 Geobacillus 属细菌中，启动子的活性范围不同；部分终止子对 mRNA 稳定性有影响，进而影响基因表达；Sec/SPI SP_WP062678531 分泌标签可显著提高蛋白质的分泌效率。

研究人员开发的 SubtiToolKit（STK）为革兰氏阳性菌的基因工程提供了高效、多功能的工具包。它解决了以往革兰氏阳性菌遗传工具缺乏的问题，能够实现复杂遗传电路的快速组装，在代谢工程、工业生物技术等领域具有广泛的应用前景。尽管 STK 在某些方面还存在改进空间，如 BsmBI 酶活性较低等问题，但随着研究的深入和技术的发展，这些问题有望得到解决。STK 的出现为合成生物学领域的研究提供了新的平台，推动了革兰氏阳性菌生物工程的发展，为实现定制微生物的生产奠定了坚实的基础。