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为探究 DNA:RNA 杂交水平与遗传不稳定关系，研究发现 DNA 损伤可致杂交积累，且 “后损伤” 杂交不影响基因表达和遗传稳定性。
探秘基因世界的 “神秘交织”：DNA 与 RNA 的奇妙关系新解
在微观的基因世界里，DNA 与 RNA 就像一对关系复杂的 “伙伴”，它们之间的相互作用时刻影响着生命的进程。DNA:RNA 杂交结构作为基因组中的特殊存在，在正常的生物过程中，它是 DNA 复制、转录等重要活动的 “中间帮手” ，比如在 Okazaki 片段（OF）合成时，RNA 引物会以 DNA:RNA 杂交的形式参与其中。然而，当这种杂交结构不受控制地积累时，就如同基因世界里的 “捣乱分子”，会破坏基因组的稳定状态，引发各种遗传问题，像基因突变、DNA 双链断裂（DSBs）等，严重影响细胞的正常功能，甚至可能导致疾病的发生。
一直以来，科学家们都在努力揭开 DNA:RNA 杂交结构的神秘面纱，想要弄清楚它们在基因组中的作用机制。其中一个关键问题就是，DNA:RNA 杂交结构的形成和积累，与 DNA 损伤之间究竟有着怎样的联系？是杂交结构的积累引发了 DNA 损伤，还是 DNA 损伤导致了杂交结构的出现？这个问题就像一团迷雾，笼罩在基因研究的领域，让科学家们困惑不已。而且，不同类型的 DNA:RNA 杂交结构，对基因表达和遗传稳定性的影响也各不相同，这使得研究变得更加复杂。为了驱散这团迷雾，来自法国、美国、葡萄牙、加拿大等多个国家研究机构的研究人员，包括 Rapha?l M. Mangione、Steven Pierce 等，展开了一项深入的研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员为了系统地研究 DNA:RNA 杂交水平与遗传不稳定之间的关系，设计了一系列巧妙的实验。他们采用的关键技术方法包括系统性筛选、DNA:RNA 杂交免疫沉淀测序（DRIP-seq）、体外切割实验等。在系统性筛选实验中，研究人员构建了特殊的质粒，利用高吞吐量的实验方法，在酵母突变体库中同时检测 DNA:RNA 杂交水平和遗传不稳定相关的表型。通过这种方法，他们发现了许多与杂交积累和遗传不稳定相关的基因。DRIP-seq 技术则帮助研究人员在全基因组水平上分析 DNA:RNA 杂交结构的分布情况，深入了解其在基因组中的位置和变化规律。体外切割实验则用于研究相关蛋白对特定核酸结构的作用机制，明确它们在 DNA:RNA 杂交代谢过程中的具体功能。
系统性筛选揭示 DNA:RNA 杂交新来源
研究人员构建了含有 LYS2 基因和 YFP 基因的质粒，将其导入酵母敲除文库。通过测量 YFP 的表达水平，来评估转录依赖的 DNA:RNA 杂交或 R-loop 形成导致的直接重复重组情况。经过多轮筛选和验证，他们确定了 39 个基因，这些基因的缺失会显著引发超重组表型，并且导致基因组中 DNA:RNA 杂交积累。其中，影响 Okazaki 片段加工的突变体，如 rad27Δ 或 cdc9*，表现出了极高的 DNA:RNA 杂交水平。在人类细胞实验中，使用 FEN1（Rad27 的同源物）的药理抑制剂处理后，也观察到了类似的杂交信号增强现象。这表明在酵母和人类细胞中，Okazaki 片段加工缺陷与 DNA:RNA 杂交积累之间存在着密切的联系。
Okazaki 片段加工防止转录基因上广泛的 DNA:RNA 杂交积累
为了进一步探究 DNA:RNA 杂交积累的来源，研究人员利用生长素诱导降解（AID）系统，急性消耗 Rad27 蛋白。结果发现，Rad27 的缺失导致了 DNA:RNA 杂交的积累，并且这种杂交积累主要发生在转录基因上，且具有明显的转录依赖性。通过 DRIP-seq 技术对全基因组进行分析发现，Rad27 缺失后，在已有的杂交倾向基因上，杂交信号广泛增加，但杂交结构仍然主要存在于转录单位的模板链上，并且在基因间区域没有明显积累。这说明在正常情况下，Okazaki 片段加工过程中的 Rad27 蛋白能够防止转录基因上 DNA:RNA 杂交的广泛积累。
复制产生的不连续性先于 DNA:RNA 杂交积累
研究人员对 DNA 损伤与 DNA:RNA 杂交之间的时间和因果关系进行了深入研究。通过体外实验发现，Rad27 蛋白对 5'-flap 结构的切割效率远高于对 R-loop 结构的切割效率。体内实验利用分离功能突变体 rad27-E176A 进一步证实，该突变体虽然能够正常处理 flap 结构，但在处理 R-loop 结构时存在缺陷，然而它却能完全抑制 DNA:RNA 杂交的积累。这表明未加工的 flap 积累是导致 Rad27 缺失时杂交增加的主要原因。此外，研究人员还通过调节 Exo1 的活性，发现 Exo1 过表达可以抑制 Rad27 缺失导致的生长缺陷和杂交积累，而 Exo1 失活则会协同增强杂交水平。同时，在 cdc9（DNA 连接酶 I）突变体中，由于存在未连接的 OF，也观察到了 DNA:RNA 杂交积累现象。这些结果共同证明，新合成的滞后链中的不连续性，如未加工的 flap 或未连接的 OF 之间的缺口，足以增强杂交倾向转录区域的 DNA:RNA 杂交形成。
后损伤 DNA:RNA 杂交既不影响基因表达也不影响遗传稳定性
研究人员将因 DNA 不连续性形成的 DNA:RNA 杂交定义为 “后损伤” 杂交，与因 mRNA 生物合成缺陷产生的 “前损伤” 杂交进行对比。研究发现，“后损伤” 杂交与 “前损伤” 杂交对基因组功能的影响截然不同。在 THO 复合体突变体中，“前损伤” 杂交会显著降低 RNA 聚合酶 II（RNAP II）的延伸速率，对基因表达产生明显影响；而 Rad27 缺失导致的 “后损伤” 杂交，对稳态 mRNA 水平几乎没有影响。在遗传稳定性方面，减少 “前损伤” 杂交的形成可以显著降低 THO 突变体细胞中的遗传不稳定性；但减少 “后损伤” 杂交的形成，却不能抑制 Rad27 缺失导致的超重组表型。在人类细胞实验中也得到了类似的结果，这表明 “后损伤” 杂交不会对遗传稳定性产生可测量的影响。
在这项研究中，研究人员通过一系列严谨的实验，揭示了 DNA 损伤与 DNA:RNA 杂交积累之间的关系。他们发现，在多种情况下，DNA:RNA 杂交是 DNA 损伤的结果，而非原因。特别是在 Okazaki 片段加工缺陷的情况下，复制产生的不连续性会先于杂交积累，形成 “后损伤” 杂交。这种 “后损伤” 杂交与 “前损伤” 杂交不同，它既不影响基因表达，也不显著影响遗传稳定性。这一发现为理解 DNA:RNA 杂交在基因组中的作用提供了新的视角，改写了人们对基因表达与遗传稳定性调控机制的认知。它表明 DNA:RNA 杂交的功能不能仅仅根据其在基因单位中的位置来判断，还需要考虑其形成的阶段。未来，对于 “后损伤” 杂交在不同病理情况下的作用，以及相关的调控机制，还有待进一步深入研究，这将为相关疾病的治疗和预防提供新的理论依据和潜在靶点。
