揭示人类前胶原赖氨酸修饰复合体结构奥秘，解锁胶原相关疾病新认知

为探究前胶原赖氨酸修饰机制，研究人员解析 KOGG 复合体结构，助力理解相关疾病。

　　在细胞的微观世界里，蛋白质的修饰如同一场精密的 “化妆舞会”，其中糖基化修饰尤为复杂且关键。在胶原蛋白这个大家族中，赖氨酸的 O - 糖基化（Lys-O-glyco）对于其成熟和功能发挥起着不可或缺的作用。它不仅参与了成熟胶原三螺旋的形成，还在分子间交联过程中扮演重要角色。像甘露糖结合凝集素、脂联素等胶原蛋白样蛋白，以及纤维蛋白原样蛋白 1（FGL1）和细胞通讯网络因子 1（CCN1）等，都有着葡萄糖 - 半乳糖 - 羟赖氨酸修饰，在多种生物过程中发挥调控作用。

然而，这场 “化妆舞会” 的具体流程却一直迷雾重重。在赖氨酸 O - 糖基化的过程中，涉及多个连续的酶促步骤，需要脯氨酰羟化酶（PLOD）家族成员和糖基转移酶 25 家族成员 1 / 前胶原半乳糖基转移酶 1（GLT25D1/ColGalT1）等多种酶的协同作用。LH3/PLOD3 作为一种多功能酶，在赖氨酸 O - 糖基化途径中起着关键作用，它既能催化初始的赖氨酸羟化反应，又能催化最后的葡萄糖基转移反应。GLT25D1/ColGalT1 则负责将半乳糖基连接到羟赖氨酸上。尽管单个酶的功能已有所了解，但这些酶之间如何协同工作，以及糖基转移反应的具体催化过程，仍存在许多未知。而且，相关酶功能异常会导致严重的胶原相关疾病，如 PLOD3 突变与结缔组织疾病相关，COLGALT1 基因突变与小脑血管疾病有关，这使得揭示这些机制变得更为迫切。

为了揭开这些谜团，上海交通大学医学院附属第九人民医院等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为理解胶原相关疾病的发病机制带来了新的曙光。

研究人员运用了多种关键技术方法。在蛋白表达与纯化方面，通过将人 LH3/PLOD3 和 GLT25D1/ColGalT1 的 cDNA 克隆到修饰的 pcDNA3.4 载体中，在 Expi293F 细胞中进行重组表达，随后利用亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化，获得了用于后续实验的蛋白复合体。冷冻电镜技术（cryo - EM）则是研究的核心技术，利用 Titan Krios 透射电子显微镜采集数据，并通过 RELION3 和 cryoSPARC 等软件进行数据处理，从而解析蛋白复合体的结构。此外，还通过定点突变构建突变体，运用生化检测评估 KOGG 复合体的羟化和糖基化活性，以及利用免疫共沉淀和免疫印迹技术研究蛋白间的相互作用。

下面来看具体的研究结果：

1. 人 LH3/PLOD3 和 GLT25D1/ColGalT1 形成功能性酶复合体：研究人员将重组的人 LH3 和 ColGalT1 在 HEK293F 细胞中瞬时共转染，成功纯化出稳定的蛋白复合体。经检测，该复合体具有赖氨酸羟化酶（LH）、半乳糖基转移酶（GalT）和葡萄糖基转移酶（GlcT）活性，且后续的糖基化反应依赖于赖氨酸的羟化，由此将其命名为 KOGG 复合体（Lys-O - 半乳糖基 - 葡萄糖基）。冷冻电镜二维分类显示，KOGG 复合体由两个 LH3 和两个 ColGalT1 组成，进一步的三维分类和精修得到了不同状态下复合体的电镜密度图，为后续研究奠定了结构基础。
2. KOGG 复合体的 EM 结构概述：不同状态下的 KOGG 复合体具有相似的四级结构，以 KOGG/UDP - Gal 复合体为例，LH3 和 ColGalT1 均形成同源二聚体，二者再结合形成 T 形异源四聚体。LH3 包含 N 端的 GlcT 结构域、C 端的 LH 结构域和中间的辅助结构域（AC），ColGalT1 则有 N 端和 C 端的 GalT - N、GalT - C 两个结构域。此外，还发现了三个 N - 连接糖基化位点，分别位于 LH3 和 GLT25D1/ColGalT1 上。同时，结构分析发现 GalT - N 和 AC、GalT - C 和 GlcT 结构域之间存在一定的相似性，尽管它们的序列同一性较低。
3. KOGG 复合体形成的界面：LH3 二聚体的形成除了疏水相互作用外，R695 和 D565 之间的静电相互作用也至关重要。ColGalT1 二聚体通过两个 GalT - N 结构域之间的静电相互作用和氢键稳定。而 KOGG 复合体的形成依赖于 GalT - N 结构域，它不仅介导 ColGalT1 二聚化，还通过与 GlcT^B和 ColGalT1^U的 N 端环（N - loop^U）相互作用，将 ColGalT1 组装到 LH3 上。突变实验表明，破坏这些相互作用位点会影响 KOGG 复合体的形成。
4. GLT25D1/ColGalT1 中的糖基转移酶位点：在 KOGG/UDP - Gal 和 KOGG/UDP - Glc 结构中，ColGalT1 的 GalT - N 结构域能结合相应的底物，而 GalT - C 结构域在 KOGG/UDP - Gal 中结合 UDP，在 KOGG/UDP - Glc 中几乎无额外密度，这与 ColGalT1 的催化偏好相符。GalT - N 结构域中的 DXD 基序（166 - 168 位氨基酸）与 Mn^{2 +}离子和底物相互作用，突变相关位点会影响半乳糖基转移酶活性。GalT - C 结构域则存在非典型的 EXD 基序（E435 - X - D437），突变相关位点也会导致半乳糖基转移酶活性丧失。结构分析还表明，GalT - N 可能主要维持酶的结构稳定性，而 GalT - C 更有可能是催化半乳糖基转移反应的主要位点。
5. LH3 中的糖基转移酶和赖氨酸羟化酶位点：LH3 的 LH 和 GlcT 结构域内有与金属离子和底物 / 产物分子对应的密度。突变 LH 结构域的关键残基会破坏 KOGG 复合体的三种酶活性，表明赖氨酸羟化在启动前胶原的羟化 - 半乳糖基化 - 葡萄糖基化级联反应中起关键作用。在 LH 结构域中，还发现了潜在的底物肽段密度，且 capping loop（588 - 612 位氨基酸）在冷冻电镜结构中与晶体结构存在差异，可能影响底物进入反应中心。GlcT 结构域结合 UDP，突变相关位点会损害葡萄糖基转移酶活性。
6. KOGG 四聚体复合体的聚合：通过冷冻电镜二维分类和交联实验等，发现 KOGG 复合体存在更高的寡聚状态，可形成纤维状的聚合物，以 2 + 2 四聚体为功能重复单元进行线性聚合。虽然其生物学意义尚待明确，但推测这种聚合形式可能使 KOGG 复合体能够同时催化单个多肽链上多个赖氨酸位点的修饰，对前胶原链的正确折叠和组装具有重要意义。

研究结论和讨论部分，研究人员通过解析 KOGG 复合体的结构，为理解前胶原赖氨酸修饰机制提供了重要依据。许多与胶原相关疾病的致病突变都位于 KOGG 复合体的相关结构域或界面上，如 PLOD3 的突变影响酶活性，COLGALT1 的突变与小脑血管疾病相关。同时，KOGG 复合体中各结构域的功能也进一步明确，但 AC 和 GalT - N 结构域的生物学功能仍有待深入研究。此外，KOGG 复合体的聚合形式为其功能研究提供了新的方向，尽管目前仍有一些问题尚未解决，如底物肽链的识别和跨催化位点的转运机制等，但该研究成果无疑为后续深入研究胶原相关疾病的发病机制和治疗策略提供了重要的基础，有望为相关疾病的诊断和治疗带来新的思路和方法。