删除 pcnB 基因可降低 ColE1 家族质粒拷贝数，影响耐药大肠杆菌的抗生素敏感性

为探究抗生素暴露和 pcnB 基因缺失对大肠杆菌质粒拷贝数（PCN）的影响，研究发现删除 pcnB 可增敏细菌，具潜在药用价值。

　　在微生物的世界里，抗生素耐药性如同一个 “超级反派”，正严重威胁着人类和动物的健康。质粒作为抗生素耐药基因的 “搬运工”，在细菌间水平转移，促使耐药性不断扩散。其中，ColE1 家族质粒携带多种耐药基因，其拷贝数（PCN）对细菌耐药水平影响重大。高拷贝数意味着更多的耐药基因，细菌耐药性也就更强。此前虽有研究关注质粒拷贝数调控，但仍存在诸多未知，比如抗生素暴露如何影响 ColE1 家族质粒拷贝数，pcnB 基因在这一过程中又扮演着怎样的角色等。为了解开这些谜团，来自丹麦哥本哈根大学和西班牙圣地亚哥德孔波斯特拉大学的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是基于测序的 PCN 测定方法，通过比对质粒 DNA 和染色体 DNA 的测序 reads 数量来估算 PCN；二是抗菌药敏试验（MIC），依据 CLSI 指南采用肉汤微量稀释法测定抗生素对菌株的最低抑菌浓度；三是细菌生长曲线测定，使用 Bioscreen C 自动化系统监测菌株在有无抗生素条件下的生长情况；四是进行了计算机模拟的同源性分析，对比 PcnB 与其他蛋白质的氨基酸序列。

研究结果

1. 验证基于测序的 PCN 测定方法：研究人员选取了研究较为充分的中等拷贝数质粒 pBR322、高拷贝数质粒 pUC19 和中等拷贝数质粒 pACYC184 的衍生物进行测试。结果显示，该方法测定的 PCN 与此前其他方法所得结果相近，且技术重复间相对标准偏差较低，表明此方法可用于相对和绝对拷贝数的定量分析。
2. 定量分析 WT 菌株和 pcnB 突变体的 PCN：研究人员将携带庆大霉素（GEN）或链霉素（STREP）抗性基因盒的 pACYC184 衍生物，分别转化到野生型大肠杆菌 MG1655 和 pcnB 缺失突变体中。发现在 GEN/STREP 存在时，野生型和 pcnB 突变体菌株的 PCN 均增加；而在无抗生素压力时，pcnB 缺失突变体的平均 PCN 显著下降，证实了 pcnB 基因在质粒拷贝数控制中的作用。
3. 对 WT 菌株和 pcnB 突变体进行表型测试：MIC 测试表明，携带 pACYC184 衍生物的 pcnB 缺失突变体对 GEN 和 STREP 的 MIC 相较于相应野生型菌株降低了 4 - 8 倍。生长分析发现，在控制条件下，pcnB 缺失突变体的生长略弱于野生型；添加抗生素后，pcnB 缺失突变体的生长受影响更大，最大生长速率下降，滞后阶段延长。此外，研究人员还对携带其他 ColE1 型质粒（如 pUC19、pBR322、ColRNAI_aph (3’)-Ia 和 Col (pHAD28)-tet (A)）的野生型和 pcnB 缺失突变体进行 MIC 测试，结果显示 pcnB 缺失突变体对相应抗生素的 MIC 均有不同程度降低。
4. PcnB 与人类及其他细菌蛋白的同源性：通过计算机模拟分析发现，PcnB 与人类蛋白质无显著同源性，但在肠杆菌科的其他成员（如大肠杆菌、志贺氏菌和克雷伯氏菌等）中存在相同的 PcnB，在其他一些细菌属中也存在序列同一性超过 80% 的 PcnB 变体。

研究结论与讨论

研究表明，删除 pcnB 基因可降低 ColE1 家族质粒的拷贝数，进而提高细菌对多种抗生素（如氨基糖苷类、β - 内酰胺类和四环素类）的敏感性。这意味着 PcnB 有望成为辅助药物靶点，用于恢复携带多拷贝耐药质粒细菌对抗生素的敏感性。此外，在无抗生素选择压力下，删除 pcnB 基因还能减少细菌群体中 ColE1 型质粒的数量，为降低细菌耐药性传播提供了新的策略。然而，本研究也存在一定局限性，如所有实验均在大肠杆菌实验室菌株 MG1655 和 LB 培养基中进行，未来需要在更多不同细菌菌株和更接近感染环境的体内模型中进行验证。

总的来说，这项研究不仅验证了基于测序的 PCN 测定方法的有效性，还揭示了 pcnB 基因在调控 ColE1 家族质粒拷贝数和细菌抗生素敏感性方面的重要作用，为解决抗生素耐药问题提供了新的思路和潜在靶点，对推动抗菌药物研发和临床治疗具有重要意义。