Click-Probe-Seq/LC-MS2揭示 4 - 羟基 - 17β- 雌二醇诱导的全基因组 DNA 损伤奥秘

研究人员利用 Click-Probe-Seq/LC-MS2技术，研究 4OHE2诱导的 DNA 损伤，为雌激素相关致癌机制研究提供新视角。

　　在人体的生命活动中，雌激素扮演着极为重要的角色，它参与了众多生理过程。正常情况下，雌激素主要通过与核雌激素受体（ER）结合，激活下游基因的转录，从而发挥其生理功能。然而，雌激素在代谢过程中会产生一些具有基因毒性的代谢产物，其中 4 - 羟基 - 17β- 雌二醇（4OHE₂）是一种典型的儿茶酚雌激素（CEs），也是雌激素激素最具基因毒性的代谢产物之一。

4OHE₂可与 DNA 形成加合物，导致 DNA 损伤。这些损伤若不能及时修复，可能引发基因突变、基因组不稳定，进而增加患癌风险。尽管此前已有研究表明内源性诱变剂 / 致癌物与肿瘤发生存在关联，但由于缺乏定量实验方法，对于 4OHE₂诱导 DNA 损伤的具体机制，包括其作用的靶基因、损伤在基因组中的分布特征以及对细胞功能的影响等，仍知之甚少。

为了深入探究这些问题，来自国立成功大学的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们运用 Click-Probe-Seq/LC-MS₂技术，对 4OHE₂诱导的 DNA 损伤进行了全基因组水平的分析。该研究成果发表在《Communications Biology》杂志上，为雌激素相关致癌机制的研究开辟了新的道路。

研究人员采用了多种关键技术方法。其中，Click-Probe-Seq 技术是一种基于点击化学的基因组测序方法，利用带有炔基的 4OHE₂类似物 4 - 羟基 - 17α- 乙炔基 - 17β- 雌二醇（4OHEE₂）作为探针，通过两步亲和纯化，实现对受损 DNA 的富集和测序，从而确定受损基因的位置。同时，结合液相色谱 - 串联质谱（LC-MS₂）技术，对释放的和稳定的 DNA 加合物进行定性和定量分析，全面了解 DNA 损伤的情况。此外，研究还运用了 RNA 测序（RNA-seq）、免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）等技术，从不同层面探究 4OHE₂对细胞的影响。

研究结果显示，在全球加合物生成谱方面，4OHEE₂与染色质 DNA 反应主要生成 4OHEE₂-G 和 4OHEE₂-dG 加合物，且在小牛胸腺 DNA 和 MCF-7 细胞染色质 DNA 中表现出不同的加合物分布特征，表明组蛋白包装对染色质 DNA 具有保护作用。通过 Click-Probe-Seq 和 DHS 位点映射发现，4OHEE₂主要靶向染色质可及区域的 DNA，尤其是富含 GC 的转录相关结构域，且这些区域与 DNase 超敏感位点（DHS）高度相关。

序列和生物信息学分析受损基因表明，4OHE₂与 DNA 的相互作用可能不依赖于 αER 介导的途径，而是优先与靶基因启动子、外显子和非翻译区（UTR）的富含 GC 序列相互作用。在基因转录比较研究中，4OHE₂或 4OHEE₂处理会抑制靶基因的转录，这与 E₂处理的结果不同。

在 DNA 损伤和修复方面，E₂、4OHE₂和 4OHEE₂均可诱导双链断裂（DSBs），但 4OHE₂或 4OHEE₂诱导的损伤积累会使修复机制失效，导致修复效果不如 E₂处理。细胞活力可比性研究发现，E₂处理可增强细胞活力，而 4OHE₂或 4OHEE₂处理则会降低细胞活力。

研究结论指出，4OHE₂主要靶向染色质暴露且富含 GC 的区域，而非通过 ERα 途径。其诱导的 DNA 损伤会抑制靶基因转录，导致 DNA 修复不足，进而降低细胞活力。Click-Probe-Seq/LC-MS₂技术成功揭示了 4OHE₂诱导的全基因组 DNA 损伤情况，为研究癌症发生与 DNA 突变或细胞转化之间的关系提供了重要数据。

这项研究具有重要意义。它首次绘制了由内源性人类代谢物引起的染色质 DNA 损伤的综合图谱，为理解雌激素相关致癌机制提供了新的视角。研究结果有助于开发预防策略和治疗干预措施，以应对雌激素相关的癌症发生。同时，Click-Probe-Seq/LC-MS₂技术也为探索其他共价 DNA 损伤提供了有力工具，有望推动癌症研究领域的进一步发展。