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为解决灵芝酸（GAs）产量低的问题，研究人员探究能量代谢对其合成影响，发现 ATP 缺乏可促 GAs 积累。
一、研究背景
灵芝，作为一种在东亚地区久负盛名的药食两用真菌，其蕴含的灵芝酸（Ganoderic acids，GAs）具有免疫调节、抗癌、抗衰老等多种强大的药理活性，是灵芝发挥药用价值的关键成分。然而，从天然来源获取的 GAs 产量极低，这就像一道难以跨越的鸿沟，严重阻碍了其在制药和保健品行业的广泛应用。
以往研究发现，环境变化会对生物的能量代谢产生影响，进而可能改变生物活性化合物的合成。在这个微观的生命世界里，能量代谢就像一台精密的仪器，控制着生物的各种生命活动。比如，在酿酒酵母中，ATP 水平的变化能调节细胞在热应激和饥饿状态下的胞质粘度；在拟南芥中，缺氧引发的 ATP 消耗会调控油酰辅酶 A 的合成，以应对低氧胁迫。但在灵芝中，环境变化究竟如何影响能量代谢，以及这又怎样影响 GAs 的合成，这些问题一直像迷雾一样，笼罩在科研人员的心头，亟待解决。
为了揭开这些谜团，来自南京农业大学农业环境微生物学重点实验室等机构的研究人员，踏上了探索之旅。他们深入研究能量代谢在灵芝 GAs 生物合成中的调控作用，期望能找到提高 GAs 产量的新方法，这一研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为灵芝酸的生产带来了新的希望。
二、研究方法
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：
- 基因沉默技术：利用 RNA 干扰（RNAi）技术，对 ATP 合酶 β 亚基（ATPsyn-β）等相关基因进行沉默，以此来探究这些基因对灵芝酸合成和能量代谢的影响。
- 高效液相色谱（HPLC）技术：用于测定灵芝菌丝体中 GAs 的含量，通过精确测量，能够清晰地了解在不同处理条件下 GAs 含量的变化情况。
- 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）技术：该技术可以定量分析基因的表达水平，研究人员借此检测 GAs 生物合成途径中关键基因以及参与能量代谢相关基因的转录水平变化。
- 免疫荧光终点法：运用此方法检测乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）的含量，明确在能量代谢变化过程中，乙酰辅酶 A 这一关键物质的含量波动。
三、研究结果
- 细胞内 ATP 减少诱导灵芝细胞内 GAs 积累：研究人员发现，当灵芝暴露在热应激（HS）、氮饥饿（NS）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理等环境下时，GAs 含量显著增加，分别提高了 170.5%、46.3%、52.4% 和 50.7%；与此同时，细胞内 ATP 含量却明显降低，下降幅度分别达到 60.0%、67.0%、74.5% 和 52.0%。这一现象表明，在特定环境刺激下，灵芝中 GAs 含量与细胞内 ATP 水平之间可能存在着某种反向关联。
为了进一步验证这一关系，研究人员用 ATP 合酶抑制剂寡霉素（Oli）处理灵芝，并对 ATPsyn-β 进行 RNAi 干扰。结果显示，Oli 处理后，细胞内 ATP 水平显著下降，在 0.5 μM、1.0 μM 和 2.0 μM Oli 处理组中，ATP 水平分别下降了 68.9%、91.7% 和 91.1%，而 GAs 含量则分别显著提高了 66.7%、62.9% 和 72.8%。在 ATPsyn-β RNAi 干扰菌株中，ATP 含量较野生型（WT）菌株大幅降低，ATPsyn-β-1i 和 ATPsyn-β-12i 菌株的 ATP 含量分别下降了 69.3% 和 75.2%，GAs 含量则分别升高了 47.8% 和 39.1%。此外，qRT-PCR 分析表明，细胞内 ATP 缺乏会显著上调 GAs 生物合成途径中关键基因 HMG-CoA 还原酶（HMGR）、角鲨烯合酶（SQS）和氧化角鲨烯环化酶（OSC）的转录水平。这些结果充分表明，细胞内 ATP 缺乏确实能够导致灵芝中 GAs 含量增加。2. 细胞内 ATP 缺乏改变乙酰辅酶 A 主要来源途径的活性：GAs 通过甲羟戊酸（MVA）途径生物合成，乙酰辅酶 A 是该途径的起始物质。研究发现，细胞内 ATP 缺乏会使乙酰辅酶 A 含量显著增加。用 2 μM Oli 处理后，细胞内乙酰辅酶 A 含量相比对照组大幅增加 104.1%；在 ATPsyn-β RNAi 干扰菌株中，ATPsyn-β-1i 和 ATPsyn-β-12i 菌株的乙酰辅酶 A 含量分别比 WT 菌株增加 118.3% 和 105.9%。
进一步探究乙酰辅酶 A 积累的机制发现，细胞内 ATP 缺乏会影响其主要来源途径。一方面，参与丙酮酸氧化脱羧、糖酵解和脂肪酸 β- 氧化关键酶的转录发生变化。糖酵解途径中，己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK）的转录在 ATPsyn-β 沉默菌株和 Oli 处理组中呈现不同程度的上调；而丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）相关亚基基因的转录则无显著变化。另一方面，细胞内 ATP 缺乏导致丙酮酸脱氢酶活性降低，总脂肪酶活性增加。此外，脂肪酸 β- 氧化途径中，中链酰基辅酶 A 脱氢酶（ACD）、3 - 羟酰基辅酶 A 脱氢酶（HCD-R2）和三酰甘油脂肪酶（TGL）基因的转录上调。通过对 ATPsyn-β 与 acd 或 hcd-r2 共沉默转化体的研究发现，敲低 acd 或 hcd-r2 可减轻细胞内 ATP 缺乏诱导的乙酰辅酶 A 积累。这一系列结果表明，脂肪酸 β- 氧化可能是细胞内 ATP 缺乏条件下乙酰辅酶 A 积累的主要贡献途径。3. 脂肪酸 β- 氧化在细胞内 ATP 减少诱导的 GAs 积累中起重要作用：为了明确脂肪酸 β- 氧化在细胞内 ATP 减少诱导的 GAs 积累中的作用，研究人员用脂肪酸 β- 氧化途径抑制剂依托莫司（eto）处理灵芝菌丝体。结果显示，添加 10 μM eto 后，WT 菌株的 GAs 含量没有变化，但在 ATPsyn-β-1i 和 ATPsyn-β-12i 菌株中，GAs 含量的增加被显著逆转，分别下降了 36.9% 和 30.5%，恢复到未处理时 WT 菌株的水平。在 2 μM Oli 处理的 WT 菌株组中，添加 10 μM eto 后，诱导的 GAs 含量降低至对照组水平，下降了 31.2%。
此外，研究人员利用 ATPsyn-β 和 HCD 共沉默转化体进一步证实了脂肪酸 β- 氧化的作用。结果显示，共沉默菌株中 GAs 生物合成相关基因的转录水平与 WT 菌株相似，这表明沉默 acd 或 hcd 消除了 ATPsyn-β 沉默导致的乙酰辅酶 A 和 GAs 积累，并且共沉默逆转了 ATPsyn-β 沉默诱导的 GAs 生物合成关键酶编码基因的转录上调。这些结果充分表明，脂肪酸 β- 氧化在细胞内 ATP 缺乏诱导的 GAs 积累过程中发挥着至关重要的作用。
四、研究结论与意义
这项研究揭示了细胞内 ATP 缺乏与灵芝中 GAs 积累之间的紧密联系。细胞内 ATP 缺乏会通过激活脂肪酸 β- 氧化途径，增加乙酰辅酶 A 的含量，进而上调 MVA 途径，促进 GAs 的生物合成。这一发现为提高灵芝中 GAs 的产量提供了新的策略，例如可以通过调节 ATP 水平来实现，这对于满足市场对 GAs 的需求、降低生产成本具有重要意义。
同时，该研究也为优化灵芝的培养条件、利用基因工程改良生物合成途径以及通过环境控制提高生产效率提供了坚实的科学依据。它让我们更加深入地了解了能量代谢在调节灵芝次级代谢中的作用机制，为今后在真菌次级代谢调控领域的研究开辟了新的方向，有望推动相关产业的进一步发展。
