模仿 HIV 的融合病毒样颗粒 T-FVLPmCAR用于体内生成 CAR-T 细胞治疗癌症

CAR-T 细胞疗法在癌症治疗中潜力巨大，但传统方法存在局限。本文介绍 T-FVLPmCAR，其能高效安全制备 CAR-T 细胞。

　　### 一、CAR-T 细胞疗法现状与挑战
基因工程改造的嵌合抗原受体（CAR）-T 细胞在血液恶性肿瘤治疗方面成果显著，为多种疾病治疗带来希望。不过，传统的 CAR-T 细胞制备依赖体外病毒感染，过程繁琐、成本高昂，还伴随着细胞因子释放综合征（CRS）和致瘤性等风险。

相比之下，mRNA 作为一种潜在的治疗药物，能在细胞内快速表达功能蛋白，且无需基因整合，安全性较高。于是，有研究尝试用抗体修饰的脂质纳米颗粒（LNPs）将 CAR mRNA 递送至 T 细胞，简化了制备流程，提升了安全性。然而，T 细胞对 LNPs 的摄取能力差，且 LNPs 的内体逃逸效率低，导致 CAR mRNA 的递送效率受限。因此，开发一种能在体内特异性、高效地将 mRNA 递送至 T 细胞的新型载体迫在眉睫。

二、T-FVLP_mCAR的设计灵感

人类免疫缺陷病毒（HIV）是一种 RNA 病毒，由包膜、衣壳和基因组 RNA 构成，可感染人类 CD4⁺ T 细胞。HIV 包膜糖蛋白 gp160 能识别 T 细胞上的 CD4 分子，促使病毒包膜与 T 细胞膜融合，将由衣壳 gag 包裹的基因组 RNA 直接送入 T 细胞胞质，绕过内吞途径。而且，有研究表明突变的 gp160 可靶向 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞，扩大了靶向 T 细胞亚群的范围。基于此，研究人员受 HIV 独特的 RNA 递送方式启发，利用其膜融合机制，设计出一种 T 细胞特异性融合病毒样颗粒（T-FVLP_mCAR），用于在体内高效递送 CAR mRNA，制备瞬时的人 CAR-T 细胞。

三、T-FVLP 的构建与特性

为制备 T-FVLP，研究人员将编码突变 gp160 包膜糖蛋白和 Peg10 衣壳蛋白的质粒同时转染到 293T^B2M?/?生产细胞中。48 小时后，收集细胞上清液，经澄清和超速离心，得到 T-FVLP。

T-FVLP 呈球形囊泡状，直径为 97.2nm，多分散指数（PDI）为 0.155，每 1×10⁷个生产细胞可产生 1.5×10⁹个 T-FVLP 颗粒。结构分析显示，T-FVLP 由突变 gp160 和 Peg10 组成，而普通病毒样颗粒（VLP）仅含 Peg10。

研究人员进一步评估 T-FVLP 与人类 T 细胞膜特异性融合的能力。他们用荧光染料 DiD 标记 VLP 和 T-FVLP，与包含多种细胞类型的人外周血单个核细胞（PBMCs）共同孵育。免疫荧光成像和流式细胞术分析结果表明，T-FVLP 能特异性地与人类 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞融合，且融合过程由突变 gp160 介导。

四、T-FVLP_mCAR体外制备 αhCD19 CAR-T 细胞

为制备负载 αhCD19 CAR mRNA 的 T-FVLP_mCAR，研究人员在 293T^B2M?/?生产细胞中，共转染编码突变 gp160 包膜糖蛋白、Peg10 衣壳蛋白和 αhCD19 CAR mRNA 的质粒。αhCD19 CAR mRNA 两端带有 Peg10 的非翻译区（UTRs），有助于其有效封装到 T-FVLP_mCAR中，封装效率达 11%，几乎所有的 T-FVLP_mCAR都负载了 αhCD19 CAR mRNA，每 1×10⁹个 T-FVLP 颗粒可负载 9.5ng 的 CAR mRNA。

在评估 T-FVLP_mCAR递送 αhCD19 CAR mRNA，将 T 细胞重编程为 αhCD19 CAR-T 细胞的效率时发现，T-FVLP_mCAR能特异性地将 αhCD19 CAR mRNA 递送至 T 细胞，转导 24 小时后，αhCD19 CAR-T 细胞的比例可达 18.4% 。随着时间推移，CAR 表达迅速下降，这一特性可能有助于减轻 CRS。而且，T-FVLP_mCAR制备的 αhCD19 CAR-T 细胞对 CD19 抗原具有结合活性，对人 CD19⁺肿瘤细胞具有抗原特异性细胞毒性，对非靶细胞如 A375 黑色素瘤细胞和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞无明显细胞毒性。此外，T-FVLP_mCAR在 - 80°C 储存 7 天内稳定性良好，且对 T 细胞无明显细胞毒性。

五、T-FVLP_mCAR体内制备 αhCD19 CAR-T 细胞

鉴于 T-FVLP_mCAR在体外能特异性地与 T 细胞膜融合并制备人 CAR-T 细胞，研究人员进一步探究其在体内制备 CAR-T 细胞的效率。他们将免疫缺陷的 NCG 小鼠移植人 PBMCs，构建人源化免疫系统模型。给小鼠静脉注射 DiD 标记的 VLP 和 T-FVLP 后发现，T-FVLP 组人 CD3⁺ T 细胞中 DiD 阳性细胞的比例显著高于 VLP 组，证实 T-FVLP 能在体内特异性地与 T 细胞融合。

接着，研究人员给小鼠静脉注射 T-FVLP_mCAR，结果显示，T-FVLP_mCAR能将血液循环中 3.2% 的人 CD3⁺ T 细胞重编程为 αhCD19 CAR-T 细胞，且在非 T 细胞中几乎无 αhCD19 CAR 表达。这表明突变 gp160 能有效诱导 T-FVLP_mCAR与人类 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞膜融合，将 αhCD19 mRNA 递送至 T 细胞，在小鼠体内原位产生人 CAR-T 细胞。

六、T-FVLP_mCAR的体内治疗效果与安全性

既然 T-FVLP_mCAR能在体内制备 αhCD19 CAR-T 细胞，研究人员便评估其对人 CD19 阳性 B 细胞淋巴瘤的治疗效果。他们给荷瘤 NCG 小鼠静脉注射 PBS、VLP、VLP_mCAR或 T-FVLP_mCAR，结果发现，T-FVLP_mCAR组能显著抑制 Raji-Luc B 细胞淋巴瘤的生长，肿瘤生长抑制率达 83.5%，且呈剂量依赖性。高剂量的 T-FVLP_mCAR治疗后，部分小鼠肿瘤完全消退。

在临床应用中，CAR-T 细胞持续激活可能引发 CRS，导致全身炎症反应和神经毒性。而 T-FVLP_mCAR治疗后，小鼠血清中多种炎症细胞因子水平未升高，与 PBS 及其他对照组相似。治疗过程中小鼠体重无明显变化，对心脏、肝脏、肺和肾脏等组织进行组织学分析，未发现组织损伤，脑组织也无神经毒性迹象。这些结果表明 T-FVLP_mCAR具有良好的生物相容性和安全性。

七、研究总结与展望

CAR-T 细胞疗法临床疗效显著，但传统体外制备工艺复杂，存在随机基因整合风险。本研究开发的 T-FVLP_mCAR，利用突变 gp160 包膜糖蛋白特异性识别 T 细胞并触发膜融合，直接将 CAR mRNA 递送至 T 细胞胞质，原位产生瞬时的人 CAR-T 细胞，提高了 CAR mRNA 递送的特异性和效率。

与以往的体内策略相比，T-FVLP_mCAR通过细胞特异性膜融合而非内吞作用递送 mRNA，降低了 CRS 和随机基因整合相关致瘤风险，且能直接在体内给药，减少污染风险，简化治疗流程，降低治疗成本和时间。不过，该研究仍存在一些问题。目前 T-FVLP_mCAR的生产和纯化技术有待改进，以提高产量和纯度；还需在灵长类动物模型中进一步评估安全性和生物相容性；治疗实体瘤时，CAR-T 细胞面临肿瘤免疫抑制微环境的挑战，可尝试将 T-FVLP 递送 CAR mRNA 与其他 mRNA 分子联合，增强治疗效果。

总体而言，T-FVLP_mCAR模仿 HIV 的主动识别和膜融合机制，高效特异性地将 CAR mRNA 递送至人 T 细胞，提升了 CAR-T 细胞疗法的效率和安全性，为癌症治疗开辟了新方向。未来可探索设计更具特异性和膜融合效率的细胞特异性融合剂，拓展其治疗应用范围，减少副作用。