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为治疗视网膜色素变性（RP），研究人员用双 AAV 递送 PE 系统，有效改善小鼠视力，提供新疗法。
视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa，RP）是一种常见的遗传性视网膜疾病，它就像眼睛里的 “隐形杀手”，悄无声息地破坏着人们的视力。RP 主要表现为视网膜光感受器进行性退化，患者往往在青少年时期就开始出现夜盲症状，随着病情发展，视野逐渐缩小，最终可能导致失明。目前，全球约每 4000 人中就有 1 人受其困扰，然而，针对 RP 却缺乏有效的治疗方法。
在基因编辑领域，点突变是许多遗传性疾病的 “罪魁祸首”，约占已知人类致病遗传变异的一半。传统的基因编辑技术在纠正这些突变时困难重重，而先导编辑（Prime editing，PE）作为新一代基因编辑工具，具有高效精确纠正点突变、脱靶效应低等优点，无需双链断裂（DSBs）或同源序列模板，在多种遗传性疾病治疗中展现出巨大潜力，这也为攻克 RP 带来了新的希望。
上海交通大学医学院附属第九人民医院等机构的研究人员，为了探索 PE 能否为 RP 的治疗带来转机，开展了一项极具意义的研究。他们以携带 Pde6b 基因无义突变（c.1041C>A p.Y347X）的 rd1 小鼠为研究对象，这一突变会导致 PDE6B 蛋白无法正常表达，进而引发光感受器退化，是 RP 的经典临床前小鼠模型。研究结果令人振奋，该研究不仅在体内成功纠正了 Pde6b 基因的突变，还显著恢复了 PDE6B 蛋白的表达，有效保护了视杆细胞，改善了小鼠的视觉功能。相关研究成果发表在《Nature Communications》上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，利用生物信息学工具，通过 PE-Designer、pegIT 和 PrimeDesign 三个网站设计针对 Pde6b 基因的 pegRNA 和 nsgRNA。接着，构建报告系统，在人胚肾 293T 细胞中进行体外筛选，确定高效的 pegRNA 和 nsgRNA 组合。随后，将选定的组合包装到双腺相关病毒（AAV）系统中，通过视网膜下注射导入 rd1 小鼠体内。同时，运用高通量 DNA 测序、AID-seq 和 PE-tag 等技术评估编辑效率和脱靶效应，利用 RNA 测序分析光转导相关基因的表达变化，借助行为学实验和电生理检测评估小鼠视觉功能。
研究结果如下：
- PE 系统设计与体外筛选：针对 Pde6b 基因的 Y347X 突变设计 PE 系统，从三个网站输出结果中随机选取 12 对 pegRNA 和 nsgRNA（pn1 - 12）。通过构建报告系统，在 HEK293T 细胞中进行体外筛选，结果显示转染 pn4 的细胞中 PDE6B - FLAG 蛋白和 GFP 表达水平最高，其靶向编辑效率达 27.96 ± 6.27%，因此选择 pn4 进行后续研究。
- 体内 PE 纠正突变并促进光感受器存活：考虑到 AAV 载体的装载容量限制，构建双 AAV2 系统，将 nCas9 拆分包装，并在载体中构建工程化 pegRNA（epegRNA）和截短的 RTARnH。在 rd1 小鼠 1 周龄时进行视网膜下注射双 AAV2 系统，4 - 5 周龄时进行功能检测。深度测序结果显示，体内编辑效率可达 26.47 ± 13.35%。Western blot 分析表明，PE 编辑后的 rd1 小鼠 PDE6B 蛋白表达恢复至野生型小鼠的 39%。免疫组化结果显示，PE 处理后的小鼠视网膜外核层（ONL）厚度显著增加，视杆细胞存活数量明显增多，表明 PE 治疗成功纠正了 PDE6BY347X突变，恢复了野生型 PDE6B 蛋白表达，促进了光感受器存活。
- 体内 PE 的脱靶效应评估：采用 AID - seq 和 PE - tag 两种方法评估 PE 系统的脱靶效应。AID - seq 提名潜在脱靶位点后，扩增子测序分析显示处理组动物样本在这些位点的插入缺失（indel）率与未处理的 rd1 小鼠背景无显著差异。PE - tag 结果显示，体外实验中 rd1 小鼠基因组 DNA（gDNA）上靶位点的独特分子标识符（UMI）计数领先，脱靶位点的编辑活性较低。综合两种方法表明，PE 系统在体内纠正致病突变的同时，产生的脱靶效应可忽略不计。
- 体内 PE 对光转导相关基因表达的影响：对野生型、rd1 小鼠和 PE 编辑后的小鼠视网膜进行高通量 RNA 测序。KEGG 富集分析显示，与未处理的 rd1 小鼠相比，PE 处理显著上调了光转导通路。RT - qPCR 验证结果表明，PE 编辑后，视杆细胞特异性基因（Pde6b、Cnga1 和 Rho）、视锥细胞特异性基因（Arr3、Opn1mw 和 Pdc）、其他光转导相关基因（Rbp3、Grk1 和 Gnat1）以及视网膜神经节细胞（RGC）再生基因（Cryga、Cryge 和 Crygf）的表达水平均显著增加，表明 PE 编辑可挽救光转导相关基因的表达，支持光感受器细胞存活。
- 体内 PE 对 rd1 小鼠视觉功能的改善：对小鼠进行暗适应视网膜电图（scotopic ERG）检测和一系列行为学实验。scotopic ERG 结果显示，PE 编辑后的小鼠 a 波和 b 波振幅明显恢复。行为学实验中，瞳孔光反射（PLR）实验表明 PE 处理的 rd1 小鼠对光刺激的反应明显增强；光暗转换实验和视觉悬崖实验结果显示，PE 处理的 rd1 小鼠在黑暗环境中的停留时间增加，在视觉悬崖边缘的停留时间减少，表明其视觉功能得到显著改善。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次将 PE 应用于治疗 RP 的 rd1 小鼠模型，证明了其在纠正致病突变、抑制光感受器退化和挽救视力方面的有效性。PE 系统展现出精确的基因组编辑能力，编辑效率高且脱靶效应低。然而，研究也存在一些局限性。例如，虽然在体外对多种先进的 PE 系统进行了验证，但考虑到系统大小和体内应用证据等因素，体内实验仅选择了 PE3 系统，未来可进一步研究其他先进 PE 系统在体内的效率。此外，AAV 载体的装载容量有限，目前的 PE 系统仍超出其最佳承载能力，未来有望开发单 AAV 携带的最小化 PE 系统，以降低体内病毒载量。同时，可优化 AAV 血清型，增强其对视网膜尤其是光感受器的靶向性；利用光感受器特异性启动子，如视紫红质激酶（RK）启动子，促进目的基因在光感受器中的表达。
总的来说，这项研究为 RP 的治疗提供了新的策略和希望，虽然目前仍面临一些挑战，但随着技术的不断改进和完善，PE 介导的治疗有望在未来成为 RP 乃至其他遗传性疾病治疗的有力武器，为广大患者带来光明的前景。
