激活内源性全长抗肌萎缩相关蛋白：杜氏肌营养不良症的潜在新疗法

为解决杜氏肌营养不良症（DMD）治疗难题，研究人员开发 MyoAAV-UA 系统，发现其可有效改善疾病症状，有临床应用潜力。

　　杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种常见的儿童期起病的遗传性神经肌肉疾病，就像一个隐匿在孩子成长道路上的 “恶魔”。每 3500 - 5000 名男性活产婴儿中，大约就有 1 名会不幸被它 “盯上”。患有 DMD 的男孩，在 2 - 4 岁时，就会逐渐出现爬楼梯困难、走路摇摆等症状，到了 12 岁左右，往往只能依靠轮椅行动，而在二十岁出头，更可能因心肺功能衰竭而失去生命。

目前，DMD 仍无法治愈。它是由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因（DMD）突变引起的，针对其治疗的研究主要围绕恢复 dystrophin 的功能展开。然而，反义寡核苷酸（ASOs）、提前终止密码子、微 / 迷你 dystrophin 基因疗法等策略，都存在患者覆盖范围有限、治疗效果欠佳、成本高昂以及免疫原性等问题，就像一道道难以跨越的 “关卡”，阻碍着 DMD 治疗的发展。

抗肌萎缩相关蛋白（utrophin）与 dystrophin 有着约 85% 的同源性，在 DMD 患者肌肉中，utrophin 会在肌膜上重新表达，一定程度上增强早期肌肉功能。因此，上调 utrophin 表达并确保其在膜上定位，被视为一种有前景的治疗方法。目前，过表达 utrophin 主要有激活内源性全长 utrophin 和递送外源性合成微 utrophin 基因或蛋白两种途径。但外源性微 utrophin 是否能完全替代全长蛋白的功能尚不明确，相比之下，激活内源性全长 utrophin 可能具有功能完整、适用于所有 dystrophin 突变类型和位点、无免疫原性等优势。此前，虽然药物激活内源性 utrophin 在 DMD 小鼠模型中显示出一定效果，在临床试验中也有过尝试，但疗效的持久性存在问题。CRISPR 激活（CRISPRa）系统理论上可用于激活内源性 utrophin，然而现有基于 dCas9 的激活剂因体积过大，难以通过腺相关病毒（AAV）高效递送，且其可行性、有效性和长期可持续性也有待探索。

为了攻克这些难题，昆明理工大学灵长类生物医药研究国家重点实验室等机构的研究人员开展了一项研究，开发出一种基于紧凑型 dCasMINI - VPR 系统的肌肉靶向 utrophin 激活系统 ——MyoAAV - UA，并对其疗效、安全性和长期可持续性进行评估。相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员在研究过程中，运用了多种关键技术方法。实验动物方面，使用了 mdx 小鼠、Dmd^ΔEx50小鼠和 4 只 1.5 岁雄性食蟹猴；细胞实验则涉及小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro 2a）、食蟹猴骨骼肌细胞（MSkM）、人胚肾 293T 细胞（HEK293T）以及从 DMD 患者外周血单核细胞（PBMCs）诱导生成的诱导多能干细胞（iPSCs）等。研究中还利用了 RT - qPCR、免疫印迹、免疫荧光染色、转录组分析等多种检测技术，以探究 MyoAAV - UA 的作用效果。

MyoAAV - UA 有效激活不同 Dmd 小鼠模型中的 utrophin

研究人员设计了 18 - 20 条靶向 Utrn/UTRN 基因启动子区域的 sgRNA，分别在小鼠、食蟹猴和人的细胞中进行实验。结果发现，dCasMINI - VPR 系统能显著上调 utrophin 表达，且某些 sgRNA 组合（如 M8 + M12、Rh13 + Rh17、H1 + H10）的激活效率更高。随后，研究人员构建了 MyoAAV - UA 系统，在 mdx 小鼠和 Dmd^ΔEx50小鼠模型中进行验证。肌肉注射 MyoAAV - UA 后，两种小鼠的 utrophin 蛋白和 mRNA 水平均显著上调，utrophin 在肌膜上表达增加，且 MyoAAV - UA 具有肌肉特异性和剂量依赖性激活效果。同时，RNA - seq 分析表明 MyoAAV - UA 无明显脱靶效应。

激活内源性 utrophin 可减轻 mdx 小鼠的营养不良表型并具有长期效果

给 2 周龄 mdx 小鼠全身注射 MyoAAV - UA 后，在 8 周和 6 个月时检测发现，肌肉中 utrophin 表达持续增加，肌肉病理症状得到改善，包括炎症细胞浸润减少、中央核肌纤维百分比降低、肌纤维排列和完整性改善、纤维化减轻等。此外，血清肌酸激酶（CK）水平下降，肌肉力量和运动耐力提升，且这些改善在 6 个月时依然存在，表明 MyoAAV - UA 具有长期疗效和安全性。

激活内源性 utrophin 可减缓 mdx 小鼠心脏功能恶化

心力衰竭是 DMD 患者的主要死亡原因之一。研究人员对注射 MyoAAV - UA 后的小鼠心脏进行分析，发现 8 周和 6 个月时，心脏中 utrophin 表达增加，心肌炎症细胞浸润和纤维化减少。转录组分析显示，MyoAAV - UA 处理组的心肌基因表达模式更接近野生型，表明 MyoAAV - UA 能改善心脏病理和功能。

MyoAAV - UA 在非人灵长类动物（NHPs）中激活内源性 utrophin 显示出有效性和安全性

研究人员以 4 只 1.5 岁雄性食蟹猴为研究对象，给其中两只注射 5×10¹³ vg/kg 的 MyoAAV - UA，另外两只注射生理盐水作为对照。结果显示，注射 MyoAAV - UA 后，食蟹猴骨骼肌中 utrophin 表达显著增加，且未观察到明显副作用，表明 MyoAAV - UA 在大型动物中具有有效性和良好的安全性。

激活 utrophin 可上调 DMD 患者 iPSC 衍生的成肌细胞中的 UGC

研究人员从两名 DMD 患者的 PBMCs 诱导生成 iPSCs，并分化为骨骼肌细胞。向这些细胞中添加 MyoAAV - UA 后，发现 utrophin 表达显著上调，α - 肌聚糖和 γ - 肌聚糖表达也增加，表明 UGC 得到恢复，显示出 MyoAAV - UA 在 DMD 患者治疗中的潜在应用价值。

研究表明，MyoAAV - UA 能在小鼠、NHPs 和人类细胞中有效激活全长 utrophin。在 mdx 小鼠中，utrophin 上调显著减轻了营养不良症状，且在 NHPs 中未观察到明显副作用。这一研究成果为 DMD 的治疗提供了一种有前景的方法，为未来的临床转化奠定了基础。不过，研究也存在一些局限性，如不同 DMD 基因突变类型对 utrophin 激活效率的影响机制尚不清楚，mdx 小鼠模型不能完全模拟人类患者的疾病进展等。未来还需要进一步研究，以更好地理解相关机制，并开发出更有效的治疗策略。