Kallikrein-8：黑色素瘤中激活素 A 前体加工的关键调控因子及潜在治疗靶点

为探究黑色素瘤中激活素 A（Activin-A）前体加工机制及对肿瘤生长影响，研究人员经 RNAi 筛选等研究，发现 Klk8 可调节其加工促肿瘤生长，为治疗提供新靶点。

　　在人体中，有一种名为激活素 A（Activin-A）的蛋白质，它属于转化生长因子 -β（TGF-β）家族，就像一个 “多面手”，在身体里发挥着多种作用。它能激活 SMAD2 和 SMAD3 转录因子，还能调控细胞的增殖、迁移和分化。在癌症领域，它的角色却很复杂，有时能抑制癌症进展，有时又会促进癌症发展，就像一把 “双刃剑”。在黑色素瘤中，Activin-A 的作用一直是个未解之谜，尤其是它的前体加工过程，更是充满了神秘色彩。以往的研究发现，黑色素瘤细胞能切割 Activin-A 前体，但其中的机制却不清楚，这也使得针对 Activin-A 的治疗策略一直难以开发。

为了揭开这些谜团，来自瑞士洛桑联邦理工学院（école Polytechnique Fédérale de Lausanne，EPFL）的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解黑色素瘤的发展机制以及寻找新的治疗靶点提供了重要线索。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。首先是 RNAi 筛选技术，通过构建针对多种蛋白酶的 siRNA 文库，筛选出可能参与 Activin-A 前体加工的蛋白酶。在细胞实验方面，利用多种细胞系，如 B16-F1 黑色素瘤细胞、HepG2 细胞等，进行蛋白质印迹分析（Western blot analysis），检测 Activin-A 的加工和表达情况；同时进行 CAGA-Luciferase 检测，评估 Activin-A 的信号传导活性。在动物实验中，构建了同基因黑色素瘤移植模型，将不同处理的 B16-F1 黑色素瘤细胞接种到小鼠体内，观察肿瘤生长情况，并对肿瘤组织和血浆进行分析。此外，还运用了定点突变技术，对 Activin-A 前体的特定氨基酸进行突变，探究其对加工和功能的影响。

研究结果

1. RNAi 筛选确定 Klk8 为候选蛋白酶：研究人员通过 RNAi 筛选发现，Kallikrein-8（Klk8）在黑色素瘤细胞中能够介导不依赖弗林蛋白酶（furin）的 Activin-A 前体半切割过程，生成 A70 中间产物。敲低 Klk8 可抑制 A70 形成及 Activin-A 诱导的信号传导，这表明 Klk8 在 Activin-A 前体加工中起着关键作用。
2. Klk8 的体外活性及作用机制：在无细胞实验中，Klk8 能够模拟 PCLP 活性切割 Activin-A 前体，且其活性受基本蛋白酶抑制剂的影响。进一步研究发现，Klk8 对 Activin-A 前体的切割依赖于精氨酸 310（R310），突变 R310 可阻断 Klk8 介导的半切割过程，但对 furin 的切割影响较小。这揭示了 Klk8 与 furin 在切割 Activin-A 前体时的不同作用机制。
3. Klk8 表达与癌症的相关性：通过分析公共数据库，研究人员发现 Klk8 在多种癌症中表达，且其表达与患者预后不良相关。在黑色素瘤中，Klk8 表达与 INHBA 表达存在一定关联，且在肿瘤进展过程中，Klk8 阳性的肿瘤在 II 期患者中更为常见。这提示 Klk8 可能是癌症治疗的潜在靶点。
4. Klk8 对癌细胞生长的影响：在体外实验中，诱导 Klk8 的 RNA 干扰（RNAi）可显著抑制 B16-F1 细胞的增殖和非锚定依赖性生长。在体内实验中，针对分泌 Activin-A 的 B16-F1 黑色素瘤移植瘤，诱导 Klk8 的 RNAi 能够特异性地减缓肿瘤生长，而对不分泌 Activin-A 的肿瘤则无明显影响。这表明 Klk8 在促进黑色素瘤生长中具有重要作用，且与 Activin-A 密切相关。
5. Klk8 与 furin 在体内的相互作用：在 furin 野生型肿瘤中，Klk8 敲低对 Activin-A 加工和成熟形式的积累影响不明显，但在 furin 缺陷型肿瘤中，Klk8 敲低可稳定未切割的 A110 和半切割的 A70，且不改变成熟形式 A30 的水平。这说明 Klk8 和 furin 在体内对 Activin-A 加工的作用存在互补性，且 Klk8 的作用可能被 furin 掩盖。
6. R310A 突变对肿瘤生长的影响：表达对 Klk8 抗性的 R310A 突变型 Activin-A 的黑色素瘤移植瘤，其肿瘤生长和 Activin-A 释放到循环系统的能力均受到抑制。同时，诱导 Klk8 的 RNAi 或表达 R310A 突变型 Activin-A 可增加肿瘤中浸润的 CD8⁺T 细胞比例。这表明 Klk8 通过切割 Activin-A 前体促进肿瘤生长，部分机制可能是通过减少 CD8⁺T 细胞浸润。

研究结论与讨论

这项研究首次明确了 Klk8 在黑色素瘤中介导不依赖 furin 的 Activin-A 前体半切割过程，揭示了 Activin-A 前体加工的新机制。Klk8 的发现为理解黑色素瘤的发展提供了新的视角，它不仅参与了 Activin-A 的加工，还与肿瘤生长、患者预后密切相关。通过对 Klk8 的研究，为开发针对黑色素瘤的新治疗策略提供了潜在靶点。未来的研究可以进一步探究 Klk8 在其他癌症中的作用机制，以及如何更有效地抑制 Klk8 的活性，为癌症治疗带来新的突破。