不同 NGS 方法检测实体瘤体细胞突变位点对 TMB 结果的影响：精准医疗路上的关键探索

研究人员探究不同 NGS 方法对实体瘤 TMB 检测结果的影响，发现会有影响，为临床检测提供参考。

　　# 实体瘤 TMB 检测新探：不同 NGS 方法的影响与临床启示
在癌症治疗领域，精准医疗正逐渐成为主流趋势，而肿瘤突变负荷（Tumor Mutation Burden，TMB）作为评估多种肿瘤对免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors，ICI）反应的重要预测生物标志物，备受关注。TMB 代表着肿瘤基因组中每百万碱基（Mb）编码区域的体细胞突变总数，它反映了肿瘤细胞的基因组不稳定性以及突变数量。高 TMB 值意味着肿瘤细胞具有更高的新抗原水平，这有助于免疫系统识别并清除癌细胞。因此，准确检测 TMB 对于判断患者对免疫治疗的敏感性，进而指导临床治疗决策意义重大。

然而，目前 TMB 检测面临着诸多挑战。虽然全外显子测序（Whole Exome Sequencing，WES）被视为 TMB 分析的金标准方法，但因其成本高昂且需要大量样本，在临床实践中的广泛应用受到限制。相比之下，大 Panel 检测在合理成本范围内提供了更深的测序深度，更适合临床 TMB 检测。在大 Panel 检测中，主要有肿瘤组织单独检测（Tumor only，TO）和肿瘤组织与白细胞联合检测（Tumor control，TC）两种方法来识别突变基因，但这两种方法是否会对 TMB 检测结果造成差异，此前尚未得到充分评估。

为了解决这些问题，贵州医科大学附属肿瘤医院的研究人员 Xueshu Chen、Haixing Chen 等人开展了相关研究，研究成果发表在《BMC Cancer》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展此项研究。在样本方面，收集了来自贵州医科大学附属肿瘤医院的 24 例新诊断实体瘤患者的福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded，FFPE）样本。在检测过程中，运用了基于杂交捕获原理的 NGS 方法构建文库，通过可逆末端测序技术进行测序。生物信息分析上，TO 方法利用特定公式计算 TMB，TC 方法则通过评估 SNP 位点的亚等位基因频率等构建全基因组拷贝数图。

研究结果

1. 准确性和特异性：TO 和 TC 两种方法的检测范围有 298 个基因重叠，均能准确检测融合位点和常见实体瘤的热点突变位点，且检测到的变异与真实突变频率之间的变异系数（CV%）小于 10%，证明了两种方法具有较高的准确性和特异性。
2. 临床样本一般结果：收集的 24 例实体瘤患者 FFPE 样本涵盖多种癌症类型，包括非小细胞肺癌（14 例）、膀胱癌、胆囊癌等。患者中男性 15 例，女性 9 例，平均年龄 62 岁。
3. 临床样本测序数据质量控制：TC 组在外显子测序区域的预文库总量和中位测序深度均显著高于 TO 组，但两种方法的其他质量控制参数，如机器数据比对率、外显子覆盖率和错误率等均合格，样本合格率达 100%。
4. 临床样本检测结果：TC 和 TO 检测到的突变分类不同，在共同检测区域的 298 个基因中，TP53、CDKN2_A等基因的点突变、插入或缺失突变较多。两种方法检测到的拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）涉及 AKT2、MYC 等基因，且不同方法在相同检测范围和位点的检测位点及数量存在差异。
5. TMB 结果：两种方法的 TMB 结果一致性为 92%（22/24）。卡方检验显示 TO 和 TC 组的 TMB 结果存在显著差异，但配对样本 T 检验表明两组无显著差异。Cohen's Kappa 统计结果显示两种方法的结果一致性和重复性较高。相比 TO，TC 检测出的 TMB 值更高（15/24），且 TC 评估的 TMB 位点数量少于 TO（138<188），两种方法共选择 88 个共同位点计算 TMB。
6. 不同结果分析：在样本 12 和 14 中，TC 和 TO 的 TMB 分析结果相反。此外，膀胱癌患者 16 和头颈部癌患者 22 虽均为 TMB-H，但不同检测方法得到的 TMB 值差异较大。两种方法在不同癌症类型中的 TMB 结果不同，主要是由于识别和纳入计算的突变位点不同。

研究结论与讨论

研究表明，不同的突变过滤算法和设计 Panel 会影响 TMB 检测结果。当 TMB 结果接近 10 mut/Mb 阈值时，不同方法可能产生不同结果，进而影响临床治疗决策。因此，建议在使用 TO 或 TC 方法时，结合其他检测方法评估体细胞突变。对于遗传性肿瘤、头颈部肿瘤、膀胱癌、肾癌等罕见肿瘤，推荐使用 TC 方法。未来的 TMB 检测方法应结合不同癌症的临床和生物学特性，整合多组学方法或改进突变过滤算法，以提高 TMB 检测的准确性。

这项研究为临床 TMB 检测方法的选择提供了重要参考，有助于优化癌症免疫治疗的策略，推动精准医疗在癌症治疗领域的进一步发展，让更多癌症患者能够从精准治疗中获益 。