代谢工程助力毕赤酵母高效生产木糖醇：开启绿色可持续制造新篇

研究人员为解决木糖醇传统生产问题，利用毕赤酵母开展代谢工程研究，提高了木糖醇产量，为其工业化生产提供基础。

　　木糖醇，作为一种在食品和制药行业备受青睐的神奇物质，以其低升糖指数、甜蜜口感和抑制口腔细菌的特性，成为了健康与美味的理想之选。美国能源部更是将其列为 12 种关键增值化学品之一，随着市场需求的不断攀升，预计到 2029 年，全球木糖醇市场销售额将从当前的约 10.1 亿美元跃升至 13.7 亿美元。然而，传统的化学合成法却像是一把双刃剑，在满足部分需求的同时，也带来了诸多难题：高成本、苛刻的反应条件、安全隐患以及对环境的不友好，使得木糖醇的大规模可持续生产陷入困境。于是，科研人员将目光投向了微生物细胞工厂，试图从中找到突破困境的钥匙。

来自天津科技大学、中山大学深圳校区以及中国科学院深圳先进技术研究院的研究人员，针对上述问题开展了一项关于利用毕赤酵母（Pichia pastoris）通过代谢工程实现可持续木糖醇生产的研究。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上，为木糖醇的生产开辟了新的路径。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因工程技术，借助 CRISPR-Cas9 系统对毕赤酵母进行基因编辑，删除特定基因并整合表达盒。同时，对所需基因进行密码子优化合成，为后续实验奠定基础。其次，利用高效液相色谱（HPLC）技术，对发酵液中的木糖醇、木酮糖和 D - 阿拉伯糖醇等代谢产物进行精准定量分析，从而清晰掌握代谢过程中的物质变化情况。

研究结果如下：

1. 构建和优化 Xu5P 依赖途径：在毕赤酵母中，葡萄糖经戊糖磷酸途径（PPP）转化为 Ru5P，进而生成 Xu5P 和木酮糖，木酮糖在木糖醇脱氢酶（XDH）的催化下还原为木糖醇。研究人员过表达来自酿酒酵母（S. cerevisiae）的 ScXyl2 和树干毕赤酵母（P. stipitis）的 PsXyl2，发现对木糖醇产量提升不明显，表明木酮糖生成可能是限速步骤。随后表达具有磷酸酶活性的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）木酮糖激酶 AraL，却导致木糖醇产量降低，而删除 Xks1 后，木糖醇产量显著提高。进一步过表达 PPP 途径相关基因 ZWF、PGL1、GND1 和 RPE，虽增加了木酮糖产量，但木糖醇产量却下降，这是由于 PPP 产生的 NADPH 与依赖 NADH 的木糖醇合成存在辅酶不平衡问题。综合考虑，选择 LC09 菌株进行后续研究12。
2. 引入 D - 阿拉伯糖醇依赖途径：毕赤酵母可从 Ru5P 合成 D - 阿拉伯糖醇，而 D - 阿拉伯糖醇可在 D - 阿拉伯糖醇脱氢酶的作用下转化为木酮糖，为木糖醇合成提供前体。研究人员在 LC09 菌株中表达肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）的 D - 阿拉伯糖醇脱氢酶基因 KpDalD，得到 LC10 菌株，其木糖醇产量大幅提高，木酮糖积累增加，D - 阿拉伯糖醇水平略有下降。但进一步过表达 PsXyl2 和 KpDalD 并未提升木糖醇产量，说明限制因素并非这些酶的缺乏34。
3. NADPH 依赖的木糖醇脱氢酶提高木糖醇产量：鉴于 PPP 产生 NADPH，研究人员评估了三种 PsXyl2 突变体对木糖醇生产的影响。其中，PsXyl2与 KpDalD 共表达时，显著提高了木糖醇产量，同时降低了木酮糖和 D - 阿拉伯糖醇的产量。在 LC10 菌株中过表达 PsXyl2，木糖醇产量进一步提升，而删除本地 PpXyl2 基因可使木糖醇产量达到 1050mg/L，表明 NADPH 依赖的木糖醇脱氢酶更适合用于构建生产木糖醇的微生物细胞工厂56。
4. 系统优化高效生产木糖醇：研究人员将多种正向工程策略整合到 XP04 菌株中。删除 Xks1 同时共表达 BsAraL，木糖醇产量显著提高；共表达 ZWF、PGL1、GND1 和 RPE 进一步增强 PPP，使木糖醇和木酮糖产量略有增加；删除本地 PpXyl2 建立依赖 NADPH 依赖的木糖醇脱氢酶途径，木糖醇产量达到 1520mg/L。在丰富培养基 YPD 中培养 XP10 菌株，木糖醇产量达到 2800mg/L，产率为 0.14g 木糖醇 /g 葡萄糖，为目前报道的最高产率78。
5. 利用替代原料生产木糖醇：研究人员探索了甘油和甲醇作为替代碳源生产木糖醇的潜力。以甘油为唯一碳源时，木糖醇产量可达 7.0g/L，产率为 0.35g/g 甘油，远高于葡萄糖；而以甲醇为唯一碳源时，木糖醇产量仅为 250mg/L。分析发现，葡萄糖作为碳源会产生乙酸和木酮糖等副产物，甘油会产生木酮糖和 D - 阿拉伯糖醇，甲醇则无副产物生成，表明甘油是更有优势的碳源，但甲醇的转化效率仍需进一步提升910。

研究结论和讨论部分指出，本研究通过整合两种合成途径，并引入 NADPH 依赖的木糖醇脱氢酶，显著提高了木糖醇的产量，达到了 0.14g 木糖醇 /g 葡萄糖和 0.35g 木糖醇 /g 甘油的高产率，这是目前报道的最高水平。同时，成功利用甘油和甲醇等可持续原料生产木糖醇，为实现环境友好且经济可行的木糖醇生产提供了可能。该研究不仅为构建商业化的木糖醇生物技术生产平台奠定了坚实基础，还为后续研究指明了方向，如进一步优化关键途径酶的拷贝数、引入新的酶（如木糖醇 - 磷酸脱氢酶）、调节糖代谢途径以及探索更多可持续碳源等，有望推动木糖醇产业向更绿色、高效的方向发展。