水凝胶介导的工程化人肌源性细胞移植治疗肌肉萎缩性疾病的研究进展

这篇研究开发了一种临床相关的移植策略，用水凝胶递送工程化人肌源性祖细胞（MPCs）治疗肌肉萎缩疾病，为相关细胞疗法提供了概念验证。

　　

一、研究背景

骨骼肌负责所有的自主运动，如行走、举物等，它拥有强大的再生能力，这主要得益于肌肉卫星细胞。然而，肌肉萎缩症是一类遗传性肌肉疾病，以肌纤维的变性、再生，以及脂肪和结缔组织的积累为特征。其中，杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）最为常见，由肌营养不良蛋白（dystrophin）缺乏引起，多发于儿童时期，会导致患者失去行走能力、生活质量下降，甚至过早死亡，目前尚无治愈方法。

细胞疗法是治疗肌肉萎缩症的一种潜在途径。此前研究使用过多种具有肌源性潜能的干细胞 / 祖细胞，如卫星细胞、成肌细胞、周细胞、人骨骼肌来源的 CD133+（hCD133+）细胞等，试图恢复 dystrophin 在 DMD 小鼠肌肉中的表达。但这类疗法面临获取足够数量有肌源性潜能干细胞 / 祖细胞以实现有效移植的难题。如今，人类多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs），包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），可通过依赖或不依赖转基因的分化方案，生成无限供应的肌源性祖细胞（myogenic progenitor cells，MPCs）用于移植。

传统的细胞移植是将具有肌源性潜能的供体细胞通过肌肉注射到免疫缺陷的宿主动物体内。为提高移植效率，常需在注射前对宿主肌肉进行预处理，如辐射、冷冻损伤、氯化钡（BaCl₂）处理或使用肌毒素等，但这些方法在临床应用中受限，因为肌肉注射有创且不实用，难以覆盖大面积骨骼肌。此外，宿主肌肉的微环境也可能抑制供体细胞的存活和分化。因此，开发更好的移植方法对提高人肌源性细胞的移植效率至关重要。

组织工程方法利用天然或合成的生物材料 3D 支架，为肌肉干细胞 / 祖细胞的增殖和分化提供所需的机械特性和信号线索。已有研究将人肌源性细胞负载的水凝胶移植到宿主动物中，但仍存在诸多问题，如在 DMD 动物模型中能否支持人肌源性细胞的移植、供体来源的人肌纤维是否能产生 dystrophin、PAX7 + 细胞的来源及能否进入宿主动物的卫星细胞区室，以及长期移植的潜力和安全性等。

二、研究内容

1. DMD 和 CRISPR 校正的 MPCs 的转录组分析：研究人员重新分析了未分化的 MPCs（第 0 天，在生长培养基中培养）的转录组，使用两个数据集（GSE159273 和 GSE189053）。通过将原始 RNA 测序（RNA-seq）读数重新比对到参考人类基因组（版本 GRCh38.104），确定了 1626 个差异表达基因。基因列表功能分析显示，差异富集的基因本体（gene ontology，GO）术语与肌肉细胞分化和发育相关，同时发现与骨骼肌干细胞功能相关的信号通路在 DMD MPCs 中存在差异富集，如 p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、c-Jun 氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路、Wnt 信号通路、Notch 信号通路等。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）也表明，参与肌肉干细胞功能的基因集在 DMD MPCs 中呈负富集，而炎症反应的正调控、NOD 样受体信号通路等呈正富集。此外，转录因子 PAX7 的转录本在 DMD MPCs 中显著下调，同时与肌发生、肌肉干细胞自我更新和 Notch 信号通路相关的基因也下调，而与 p38 MAPK 信号通路、肌肉干细胞定向分化、炎症反应和衰老相关的基因上调。这些结果表明，DMD MPCs 中参与肌肉干细胞功能的信号通路失调，可能导致骨骼肌再生失败。
2. 人细胞负载水凝胶构建体在 dystrophin 缺陷小鼠中的成功异种移植：为开发临床相关的移植方案，研究人员在供体人细胞移植前不对宿主小鼠肌肉进行预处理。他们采用既定方法在聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）模具中制备工程化 3D 细胞负载构建体，将人肌源性细胞封装在纤维蛋白 / 基质胶（Matrigel）基水凝胶中培养，2 天后 3D 细胞负载构建体重塑，第 3 天移植到 dystrophin 缺陷的 mdx 裸鼠中，并在特定时间点进行分析。以健康人骨骼肌来源的 hCD133 + 细胞为对照，同时使用两种独立的 CRISPR 校正的人 PSCs 来源的 MPCs（CORR-R3381X 和 CORR-K2957fs）。移植 4 周后，苏木精和伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色显示 mdx 裸鼠胫骨前肌（tibialis anterior，TA）内存在水凝胶植入物。免疫染色显示，宿主 TA 肌中存在人源肌纤维，证明了人肌源性细胞通过水凝胶介导的递送在 mdx 裸鼠中成功异种移植。
3. CORR-R3381X 和 CORR-K2957fs MPCs 与骨骼肌来源的 hCD133 + 细胞在体内肌肉再生中的作用相似：研究人员通过量化人源肌纤维来比较不同实验条件下的体内肌肉再生效率。由于再生肌纤维中 utrophin 的表达可能导致抗人血影蛋白（spectrin）抗体检测到假阳性供体肌纤维，且肌源性细胞移植后可能与宿主细胞融合形成镶嵌肌纤维，因此研究人员将含有 hLaminA/C + 细胞核的 hSpectrin + 肌纤维和任何 hDystrophin + 肌纤维视为人源肌纤维进行量化。结果显示，所有 hCD133 + 细胞负载的构建体在移植 4 周后都有助于肌肉再生，但人源肌纤维数量在宿主小鼠中差异较大。CORR-R3381X 和 CORR-K2957fs 细胞负载的构建体在 Promocell 培养基中培养比在 Megacell 培养基中培养产生的人源肌纤维更多。总体而言，CORR-R3381X 和 hCD133 + 构建体的未分化细胞和人源肌纤维百分比相似，而 CORR-K2957fs 构建体的未分化细胞百分比更高，人源肌纤维百分比更低。这表明 CORR-R3381X 和 CORR-K2957fs MPCs 能像 hCD133 + 细胞一样促进体内肌肉再生，且合适的生长培养基可提高移植效率。
4. CORR-R3381X 和 CORR-K2957fs MPCs 产生的供体来源人肌纤维的镶嵌模式分布与 hCD133 + 细胞相似：研究人员进一步量化了供体来源人肌纤维的数量和类别，包括 hDystrophin + 仅、hSpectrin + 且 hDystrophin + 且 hLaminA/C+、hSpectrin + 且 hDystrophin+、hSpectrin + 且 hLaminA/C + 四类。结果发现，超过 99.29% 的供体来源人肌纤维表达人 dystrophin，且 CORR-R3381X 和 CORR-K2957fs 构建体产生的人肌纤维中，人特异性标记物的百分比分布与 hCD133 + 细胞相似。这表明 CRISPR 校正的人 PSCs 来源的 MPCs 在异种移植后可能以与其他人类源肌肉前体细胞类似的方式促进肌肉再生。
5. 人肌纤维的长期移植及人 PAX7 + 细胞在 mdx 裸鼠卫星细胞区室的定植：鉴于 CORR-R3381X 细胞负载构建体在移植 4 周后的移植效率较高，研究人员对其在 Promocell 培养基中培养的构建体进行 5 个月（n = 1）或 6 个月（n = 5）的移植分析。结果在 5 个月和 6 个月后的 TA 肌中检测到供体来源的人肌纤维，且未发现肿瘤发生的证据。通过对横切面的染色分析，发现人源的 hLamin A/C 和 Pax7 双阳性细胞定位于卫星细胞区室，同时也鉴定出小鼠源的卫星细胞。此外，研究还发现人肌纤维与小鼠运动神经元形成神经肌肉接头（neuromuscular junctions，NMJs），且移植区域存在血管化，表明 3D 细胞负载水凝胶构建体的移植不仅有助于体内肌肉再生，还能使人 PAX7 + 细胞定植于宿主肌肉的卫星细胞区室，支持人肌纤维的长期移植、神经支配和血管化。
6. CORR-R3381X MPCs 来源的人肌纤维在长期移植后的进一步成熟：研究人员比较了三种实验条件下（CORR-R3381X，4 周；hCD133+，4 周；CORR-R3381X，5 和 6 个月）人肌纤维的横截面积（cross-section areas，CSAs）。结果显示，虽然 hCD133 + 细胞的移植效率最高，但 4 周时其来源的人肌纤维 CSAs 显著小于 CORR-R3381X MPCs 来源的肌纤维，且 CORR-R3381X MPCs 来源的肌纤维在 5 - 6 个月时 CSAs 进一步增大。通过绘制频率分布图发现，CORR-R3381X MPCs 来源的肌纤维在长期移植后尺寸进一步增大，表明人肌源性细胞的来源可能决定移植后肌纤维的整体大小，且 CORR-R3381X MPCs 来源的肌纤维在长期移植后可能进一步成熟，未发生萎缩。

三、研究讨论

本研究建立了一种临床相关的移植策略，用水凝胶介导工程化人肌源性细胞的递送，无需对宿主肌肉进行预处理即可在 mdx 裸鼠中实现异种移植，提高了动物福利。研究表明，CRISPR 校正的人 PSCs 来源的 MPCs 和骨骼肌来源的 hCD133 + 细胞都能促进体内肌肉再生，表达全长 dystrophin，且人源肌纤维实现了神经支配和血管化，移植的人肌源性细胞产生的 PAX7 + 细胞定植于卫星细胞区室，同时未发现肿瘤发生，证明人 PSCs 来源的 MPCs 长期移植安全稳定。使用自体 MPCs 而非异体供体来源的 MPCs 可降低免疫排斥风险，减少终身免疫抑制的需求。

然而，本研究也存在一些局限性。一方面，实验中使用的纤维蛋白水凝胶添加了 Matrigel，而 Matrigel 存在批次间差异、潜在病原体传播和免疫原性等问题，需要开发无动物源的天然水凝胶或合成生物材料来替代。另一方面，供体来源的人肌纤维在小鼠 TA 肌中的比例较低，且 dystrophin 在肌纤维中的分布有限，因此未对移植后的肌肉功能进行评估。未来当人源肌纤维中 dystrophin 达到一定比例时，评估其对肌肉功能的改善作用将很有意义。

此外，研究还发现移植效率存在较大差异，可能受多种因素影响。实验和分析方法的技术问题可能导致人源肌纤维的量化不准确；移植的水凝胶构建体位置不当可能影响移植效率；裸鼠虽 T 细胞缺陷，但仍有 B 细胞活性和较高的自然杀伤（natural killer，NK）细胞功能，可能对异种移植物产生免疫排斥；不同研究中 mdx 裸鼠的遗传背景差异也可能影响人源肌纤维的数量。

总体而言，本研究表明水凝胶介导的递送适用于 CRISPR 校正的人 PSCs 来源的 MPCs 在未处理的 mdx 裸鼠肌肉中的长期移植，为开发基于水凝胶的细胞疗法提供了重要参考。未来，开发更安全有效的移植方法、优化生物材料和提高移植效率，有望为肌肉萎缩性疾病的治疗带来新的突破。