TBK1/IKKε：调控细胞死亡与炎症的关键激酶

为探究 TBK1/IKKε 缺失时细胞死亡途径选择问题，研究发现其可限制 RIPK1 和 NLRP3 死亡通路，意义重大。

　　

在细胞的生命活动中，细胞死亡与炎症的调控一直是生命科学领域的重要研究方向。TBK1（TANK 结合激酶 1）和 IKKε（核因子 κB 抑制因子激酶亚基 ε）这两种激酶，在细胞的多个生理过程和免疫反应中扮演着极为关键的角色，它们参与调节自噬、代谢、抗病毒免疫反应以及细胞死亡通路等。然而，目前对于它们在细胞死亡途径选择中的具体作用机制，科学界还存在诸多疑问。比如，在不同的刺激信号下，缺乏 TBK1/IKKε 功能的细胞究竟是通过 RIPK1（受体相互作用丝氨酸 / 苏氨酸激酶 1）还是 NLRP3（NLR 家族含 pyrin 结构域 3）驱动的途径发生死亡？这一问题亟待解决，因为它对于深入理解细胞的生命活动规律、疾病的发生发展机制以及开发新的治疗策略都具有至关重要的意义。

为了揭开这些谜团，来自国外的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》杂志上。研究发现，TBK1/IKKε 在限制细胞死亡诱导的炎症方面发挥着核心作用，它们能够调控 RIPK1 和 NLRP3 这两条死亡诱导途径。这一发现为我们理解细胞死亡和炎症的调控机制提供了新的视角，也为相关疾病的治疗提供了潜在的新靶点。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。基因编辑技术，通过 CRISPR-Cas9 介导的基因靶向，构建了缺乏 TBK1、IKKε 或两者的永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDMs）；细胞刺激与检测技术，对细胞进行脂多糖（LPS）刺激、病原体感染等处理，并检测细胞死亡、细胞因子分泌、caspase-1 裂解等指标；免疫分析技术，利用免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测相关蛋白的表达和定位。

下面详细介绍研究结果：

• TBK1/IKKε 限制 NLRP3 驱动的细胞死亡且独立于 TNF-RIPK1 信号：研究人员利用基因编辑技术构建的 iBMDMs，用 LPS 刺激后再用尼日利亚菌素刺激。结果显示，与野生型（WT）对照相比，Tbk1^?/?和Tbk1^?/?Ikkε^?/?的 iBMDMs 中 NLRP3 驱动的细胞死亡、IL-18 分泌和 caspase-1 裂解增加，这表明 NLRP3 依赖的死亡在 TBK1/IKKε 缺失时会升高。同时，在 TNFR1 敲除（Tnfr1^?/?）或 RIPK1 激酶失活（Ripk1^D138N/D138N）的细胞中，抑制 TBK1/IKKε 仍能增加 NLRP3 的反应，说明 TBK1/IKKε 对 NLRP3 途径的调节独立于 TNF-RIPK1 信号。

• TBK1/IKKε 限制巨噬细胞中 RIPK1 和 NLRP3 死亡途径的活性：研究人员通过实验发现，在没有外部微生物配体时，缺乏 TBK1/IKKε 的细胞会在 24 小时内通过不受限制的强直性 TNFR/RIPK1 信号死亡；而在存在 NLRP3 途径的微生物激活剂时，表达 NLRP3 的巨噬细胞会在 60 分钟内死亡，且独立于 TNFR/RIPK1 途径。在对原代 BMDMs 进行的实验中，用 PI 摄取试验检测细胞死亡，结果表明，缺乏 TBK1/IKKε 功能的巨噬细胞在存在 NLRP3 激活信号时，其快速增加的细胞死亡完全依赖于 NLRP3；刺激 TNF 和尼日利亚菌素也会引发快速的 NLRP3 驱动的死亡，但在后期也会涉及 RIPK1 死亡途径的部分作用。

• 细胞对感染的死亡反应在 TBK 和 IKKε 控制丧失时增强：研究人员分别用优先激活 NLRP3 的病原体单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）和优先激活 RIPK1 的病原体假结核耶尔森菌（Y. pseudotuberculosis）感染巨噬细胞。结果发现，当 TBK1/IKKε 缺陷的巨噬细胞暴露于L. monocytogenes时，会通过 NLRP3 驱动的焦亡迅速死亡；感染Y. pseudotuberculosis会使 TBK1/IKKε 抑制的细胞增强 RIPK1/caspase-8 激活和死亡，同时也会增强继发性 caspase-1 激活，且这种激活是下游 RIPK1/caspase-8 信号增强的结果，在 TBK1/IKKε 抑制的细胞中可能由钾外流和 NLRP3 激活触发。进一步研究发现，在缺乏 TBK1/IKKε 活性的细胞中，增强的 RIPK1/caspase-8 激活、caspase-1 激活和细胞死亡可能在感染细胞内发生，如果 caspase-1 在旁观者细胞中被激活，也不是由细胞死亡过程中释放的可溶性因子介导的。

• TBK1/IKKε 的缺失允许不依赖启动的 NLRP3 激活：研究人员发现，抑制 TBK1 和 IKKε 会使小鼠和人类巨噬细胞对过早的 NLRP3 激活和细胞死亡敏感，即使在没有启动信号的情况下也是如此。通过对 WT 和Tbk1^?/?Ikkε^?/?的 iBMDMs 进行刺激实验，结果表明，TBK1/IKKε 的缺失大大降低了 NLRP3 途径对信号 2 的激活阈值，使典型的启动步骤变得多余。

• TBK1/IKKε 通过细胞内在机制调节 NLRP3 激活：研究人员通过多种实验方法探究 TBK1/IKKε 调节 NLRP3 激活的机制。用蛋白质分泌抑制剂莫能菌素和转录抑制剂放线菌素 D 处理细胞，结果显示 TBK1/IKKε 对 NLRP3 激活的调节不依赖于新的转录和诱导的蛋白质分泌；通过共培养实验和上清液转移实验，发现 TBK1/IKKε 调节 NLRP3 激活是通过细胞内在机制实现的。此外，研究还发现 TBK1/IKKε 调节 NLRP3 激活是在钾外流下游、ASC 斑点形成上游，且可能在 IKKβ 上游，同时与自噬无关。

• TBK1/IKKε 的缺失破坏内体稳态并降低 NLRP3 激活的阈值：研究人员通过构建稳定表达 NLRP3-FLAG 的 HEK293T 细胞系和对原代人类 CD14⁺单核细胞衍生的巨噬细胞（HMDMs）进行实验，发现 TBK1/IKKε 抑制会导致内吞泡的异常分散，形成一个预形成的平台，促进 NLRP3 的快速激活，且独立于启动信号。

• Rab5 缺失导致的内体稳态丧失也降低 NLRP3 激活的阈值：研究人员发现，Rab7 的磷酸化受 TBK1/IKKε 控制，但敲低 Rab7 对 NLRP3 激活的阈值影响不大；而敲低早期内体效应蛋白 Rab5 则完全重现了 TBK1/IKKε 缺失时的表型，导致 NLRP3 激活和细胞死亡增强。这表明任何对早期内体稳态的破坏，无论是通过 TBK1/IKKε 的缺失还是 Rab5 的缺失，都会信号细胞应激并降低 NLRP3 激活的阈值。

综上所述，研究人员通过一系列实验，深入探究了 TBK1/IKKε 在细胞死亡途径中的作用机制。研究表明，TBK1 和 IKKε 在调节 NLRP3 和 RIPK1 驱动的细胞死亡方面起着关键作用，它们的缺失或抑制会导致髓系细胞中这两条死亡途径的过度激活。同时，TBK1/IKKε 对于维持内体稳态至关重要，其信号的破坏会导致积累的囊泡降低 NLRP3 激活的阈值，从而引发过早的焦亡。这一研究成果不仅为我们理解细胞死亡和炎症的调控机制提供了重要依据，也为相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点和思路。例如，对于患有由 TBK1 功能丧失或表达缺失突变引起的遗传疾病（如肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆）的患者，可能从双重 RIPK1 和 NLRP3 抑制剂治疗中受益，以改善神经和全身炎症。未来，进一步研究 TBK1 和 IKKε 如何调节早期内体稳态以及 Rab5 囊泡是否直接受 TBK1/IKKε 控制，将有助于我们更深入地理解细胞死亡和炎症的调控机制，为开发更有效的治疗策略奠定基础。