微生物源脂肪酶：肝癌治疗新希望的深度探索

研究人员为优化脂肪酶生产并探索其抗癌活性，对铜绿假单胞菌进行研究，发现其脂肪酶有望治疗肝癌。

　　在生命科学和医学领域，脂肪酶（lipases）作为一类能将甘油三酯分解为甘油和游离脂肪酸的水解酶，一直备受关注。它在制药、食品加工和环境生物技术等多个行业都有着广泛应用。特别是来源于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的脂肪酶，因其高效的催化能力、广泛的底物特异性以及在恶劣环境下的稳定性，更是成为研究的热点。

然而，目前肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）这一极具侵袭性的肝癌类型，正严重威胁着全球人类健康。其高死亡率和有限的治疗手段，让科研人员迫切需要寻找新的治疗方法。在此背景下，探究铜绿假单胞菌脂肪酶在 HCC 治疗中的潜力，成为了极具意义的研究方向。

为了解决这一难题，来自埃及坦塔大学药学院微生物学和免疫学系的研究人员 Amal M. Abo-Kamer、Ahmed A. Abdelaziz 等人开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先是菌株筛选与鉴定技术，从 51 个生物样本中分离出铜绿假单胞菌，并通过革兰氏染色、生化测试以及 16S rRNA 基因测序等手段进行鉴定。其次是优化培养条件技术，利用单因素实验（OFAT）和响应面法（RSM）对影响脂肪酶生产的因素进行优化。还有蛋白质纯化与分析技术，采用硫酸铵沉淀、透析和凝胶过滤层析等方法纯化脂肪酶，并通过 SDS-PAGE 电泳测定其分子量。最后是细胞实验技术，使用 MTT 法评估脂肪酶对 Vero 细胞和 HepG-2 细胞的细胞毒性，通过流式细胞术分析细胞凋亡和坏死情况，运用实时定量 PCR（qRT-PCR）检测 BCL-2 基因的表达。

研究结果如下：

• 菌株筛选与鉴定：研究人员从不同人体来源的生物样本中分离出 51 株细菌，经筛选发现 7 株具有脂肪酶产生能力，其中一株来自伤口脓液的菌株表现最为突出。通过形态学、生化特征以及 16S rRNA 基因序列分析，确定该菌株为铜绿假单胞菌，其 16S rRNA 基因序列与铜绿假单胞菌菌株 CUABODEDELE02 的相似度高达 99%，相关核苷酸序列已存入 GenBank 数据库，登录号为 PP436388。
• 脂肪酶活性测定与诱变：对脂肪酶阳性菌株进行活性测定，发现 3 株菌株的脂肪酶活性较高，范围在 89.84 - 167.96 U/ml 之间。对其中一株野生型菌株进行溴化乙锭诱变后，获得了 6 株高活性突变株，其中一株突变株的脂肪酶活性达到 312.09 U/ml，相比野生型提高了 85.87%。
• 优化脂肪酶生产条件：通过 OFAT 实验，发现 Tween 80 是最有效的碳源，能刺激脂肪酶的生物合成和分泌； peptone 是最佳的氮源，有助于提高脂肪酶活性。利用 RSM 进一步优化发酵条件，确定在 pH 9、24 h 孵育时间、2.5% Tween 80 和 2.5% peptone 的条件下，脂肪酶活性可达到 499.33 U/mg，且所构建的模型具有高度显著性和准确性。
• 脂肪酶的纯化与表征：采用硫酸铵沉淀、透析和 Sephadex G - 100 层析对脂肪酶进行纯化，确定其分子量为 53 kDa。该脂肪酶在 pH 6 - 8 和 25 - 35℃范围内具有较好的稳定性，在 pH 6 - 8 时可保留 70 - 80% 的活性，在 30℃时 1 h 后仍能保留 100% 的活性。
• 脂肪酶的抗癌活性评估：MTT 实验表明，脂肪酶对 Vero 细胞的毒性较低，在浓度低于 533.27 U/ml 时，细胞存活率接近 100%，说明其在该浓度下对人体较为安全。对 HepG-2 细胞的 MTT 实验显示，脂肪酶的半数抑制浓度（IC₅₀）为 78.21 U/ml，能诱导细胞形态发生改变，出现细胞死亡现象。流式细胞术分析证实，脂肪酶可诱导 HepG-2 细胞发生凋亡和坏死，处理后早期凋亡细胞增加了 13 倍多，晚期凋亡细胞增加了 10 倍多，坏死细胞增加了 5 倍多。qRT-PCR 结果显示，脂肪酶处理 HepG-2 细胞后，BCL-2 基因的表达显著下调 62%。

研究结论和讨论部分指出，从经济角度来看，铜绿假单胞菌具有高效的胞外脂肪酶生产能力。通过实验优化，确定了最佳的生产参数，包括碳源、氮源、pH、温度和孵育时间等。同时，研究首次评估了脂肪酶对 Vero 细胞的亚毒性浓度，证实其在一定浓度下对人体安全。更为重要的是，该脂肪酶在体外对 HepG-2 细胞表现出显著的抗癌活性，通过诱导细胞凋亡和坏死，以及下调 BCL-2 基因的表达，展现出作为治疗肝细胞癌潜在药物的巨大潜力。这一研究成果为肝癌治疗开辟了新的方向，有望为未来的临床治疗提供新的策略和药物选择。