尿液细胞外囊泡 N - 糖组学：膀胱癌诊断的新希望

为解决膀胱癌诊断难题，研究人员开展尿液细胞外囊泡（EVs）N - 糖组学研究，构建诊断模型，意义重大。

　　膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，严重威胁着人们的健康。2022 年，全球约有 61.4 万新发病例，22 万人因此失去生命。目前，膀胱癌的诊断面临着诸多挑战。膀胱镜检查虽被视为诊断的 “金标准”，但它属于侵入性操作，会给患者带来极大的痛苦；尿液细胞学检查虽然无创，但其敏感性较低，尤其是对于低级别癌症的检测效果不佳；超声、CT 等影像学技术虽然有助于判断病变程度，但同样存在敏感性低的问题。此外，一些尿液衍生的标记物，如核基质蛋白 22（NMP22）、膀胱肿瘤抗原检测（BTA stat 和 BTA trak）等，虽然在一定程度上提高了诊断的敏感性，但仍无法满足临床需求，存在特异性低、受其他因素影响大等问题。因此，开发一种高效、无创的膀胱癌诊断方法迫在眉睫。

为了攻克这一难题，来自复旦大学附属闵行医院、海军军医大学第一附属医院等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们聚焦于尿液细胞外囊泡（EVs）的 N - 糖组学，试图从中找到膀胱癌诊断的新线索。相关研究成果发表在《Nature Communications》杂志上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们收集了 333 名临床个体的尿液样本，这些样本来自上海长海医院泌尿外科。通过 EVTrap 磁珠从 1mL 尿液中分离出 EVs，该方法相较于传统方法，操作更简便、效率更高，适合大规模队列研究。随后，利用基于 96 孔板的高通量样本制备方法富集 N - 糖，并采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）获取 N - 糖组数据。此外，还运用了机器学习技术构建诊断模型，并通过蛋白质组学等方法对相关机制进行深入探究。

研究结果主要包括以下几个方面：

1. 患者、样本收集和研究设计：研究人员收集了 333 名个体的尿液样本，分为发现队列和两个独立的验证队列。在发现队列中，对 132 名个体进行 N - 糖候选标记物筛选，随后在验证队列 1（n=83）和验证队列 2（n=118）中对诊断模型进行验证。通过一系列操作，共鉴定出 252 种 N - 糖，并生成了尿液 EVs 的综合 N - 糖组图谱12。
2. EVs 的表征和质量控制：对分离出的 EVs 进行纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白质免疫印迹（WB）和透射电子显微镜（TEM）表征，结果显示所分离的尿液 EVs 纯度高、质量好，适合后续分析。同时，通过对质量控制（QC）样本的分析，证明了实验仪器的高稳定性和实验流程的可靠性34。
3. 尿液 EVs 中 N - 糖组谱的综合分析：研究发现，膀胱癌患者尿液 EVs 中的 N - 糖组存在显著变化。与健康对照组相比，膀胱癌患者尿液 EVs 中高分支和岩藻糖基化的 N - 糖水平降低，而唾液酸水平升高。此外，还鉴定出 8 种 N - 糖作为候选诊断标记物，这些标记物均为复杂或混合型，且 75% 含有唾液酸56。
4. 膀胱癌诊断模型的开发和评估：基于 8 种候选生物标志物，利用机器学习技术构建诊断模型。通过比较 9 种不同机器学习算法的性能，最终选择逻辑回归模型构建最终诊断模型。该模型在两个验证队列中表现出色，受试者工作特征曲线下面积（ROC AUC）分别达到 0.88 和 0.86，能够有效区分膀胱癌患者和健康个体，并且对非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）也有较好的区分能力78。
5. 携带癌症相关 N - 糖特征的 EV 糖蛋白的综合表征：对尿液 EVs 进行 N - 糖蛋白质组学分析，共鉴定出 7787 种糖型。通过分析发现，携带癌症相关 N - 糖特征的 EV 糖蛋白（EVcans）与免疫活动密切相关，KEGG 和 GO 富集分析表明这些蛋白参与免疫调节、补体激活等过程910。
6. 尿液 EVs 和组织 N - 糖组的成对比较分析：对膀胱癌患者的肿瘤组织、癌旁正常组织和尿液 EVs 进行 N - 糖组分析，发现肿瘤组织和癌旁正常组织的 N - 糖组存在显著差异，且尿液 EVs 与组织的 N - 糖组也有明显不同，如尿液 EVs 中的唾液酸化水平显著高于癌组织1112。
7. 膀胱癌细胞系及其衍生 EVs 的 N - 糖组差异分析：对五种膀胱细胞系及其衍生的 EVs 进行 N - 糖组学分析，发现 EVs 和其来源细胞的 N - 糖组既有相似之处，也存在显著差异。例如，EVs 中复杂或混合型 N - 糖的比例增加，唾液酸化水平显著升高，而高甘露糖型 N - 糖的比例降低1314。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功开发了一种基于尿液 EVs 的 N - 糖组分析的膀胱癌诊断模型，为临床膀胱癌筛查提供了新的方法和思路。同时，研究还揭示了膀胱癌患者尿液 EVs 中 N - 糖组的变化规律，以及这些变化与疾病发生、发展的潜在关系。不过，目前该模型在区分膀胱癌患者与良性泌尿系统疾病（UB）和其他泌尿系统恶性肿瘤（UM）患者方面的性能还有待提高，未来可通过整合临床特征或其他诊断方法来进一步增强其预测能力。总的来说，这项研究为膀胱癌的诊断和治疗开辟了新的方向，具有重要的临床意义和研究价值，有望为膀胱癌患者带来新的希望。