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为探究细胞双链 RNA(dsRNA)结合蛋白(dsRBPs),研究人员用 K1 抗体捕获 dsRNA 互作组,发现 64 种潜在 dsRBPs,为研究 dsRNA 调控提供资源。
在生命的微观世界里,
双链 RNA(dsRNA)扮演着十分重要的角色。它不仅是 RNA 病毒复制过程中的常见副产物,作为病原体相关分子模式(PAMP),能触发机体的先天免疫反应;而且人体自身基因组中的重复元件转录出的 RNA,以及线粒体通过双向转录产生的 RNA,也可形成双链结构 。然而,这些内源性 dsRNA 一旦失控,就可能引发严重后果。比如,在骨关节炎患者的滑液、自身免疫性干燥综合征患者的眼泪和唾液,以及亨廷顿病患者的血液中,都能检测到线粒体 dsRNA 水平的升高;短散在核元件(SINE)来源的 dsRNA 的失调和误识别,还与艾卡迪 - 古铁雷斯综合征和年龄相关性黄斑变性的发生有关。
尽管细胞 dsRNA 在病理过程中意义重大且具有潜在治疗价值,但目前对于 dsRNA 结合蛋白(dsRBPs)的了解却十分有限。传统用于系统性识别 RNA 结合蛋白(RBPs)的紫外线(UV)交联和寡聚 dT 磁珠下拉法,在面对 dsRNA 时却无能为力,因为 dsRNA 与 dsRBPs 之间的 UV 交联效率低,且 dsRNA 大多缺乏多聚腺苷酸(poly (A))尾巴,使得这种方法无法有效捕获 dsRBPs。因此,为了深入探索细胞 dsRNA 的调控机制,韩国科学技术院(KAIST)等机构的研究人员开展了相关研究,其成果发表在《Communications Biology》上。
研究人员采用了一种原创方法,即利用抗 dsRNA 的 K1 抗体进行免疫共沉淀(co-IP),随后进行定量质谱分析,以全面识别与细胞 dsRNA 结合的蛋白。为了降低假阳性,他们还进行了两项额外实验:一是用核糖核酸酶 T1(RNase T1)处理,以降解单链 RNA(ssRNA),确保捕获的 RNA 完全为双链;二是使用合成的 dsRNA—— 聚肌苷酸 - 聚胞苷酸(poly (I:C))进行体外下拉实验。之后,研究人员通过靶向 CRISPR-Cas9 基因敲除(KO)筛选,评估了这些潜在 dsRBPs 的调控潜力,并在病毒感染实验中进一步探索了 dsRNA 互作组的功能。
在研究结果部分,首先是鉴定人细胞中潜在的 dsRBPs。研究人员利用 K1 抗体能识别长度超过 40bp 的 dsRNA 且无序列特异性的特点,进行免疫沉淀和质谱分析。实验验证阶段,通过 RT-qPCR 检测发现,K1 抗体能显著富集内源性逆转录病毒(ERV)、部分 SINE 和长散在核元件(LINE)等来源的 dsRNA;同时,通过蛋白质免疫印迹分析证实,已知的 dsRBPs 如 ADAR1、PKR 和 STAU1 等,在 K1 共沉淀洗脱液中高度富集。大规模实验中,研究人员鉴定出 1183 种蛋白,从中筛选出 148 种进行深入分析,这些蛋白大多是以往研究未发现的。此外,研究人员还在多种细胞系中进行验证,进一步确认了这些潜在 dsRBPs 与 dsRNA 的结合。
接着是对 K1 捕获蛋白的特征分析。基因本体(GO)分析表明,这些蛋白具有多种 RNA 相关功能,如 “mRNA 3′-UTR 结合”“单链 RNA 结合” 等,其中 “双链 RNA 结合” 是最显著富集的功能。结构域富集分析也显示,RNA 结合结构域和螺旋酶结构域显著富集。
然后是对 K1 互作组 dsRNA 结合能力的验证。研究人员用 RNase T1 处理细胞裂解液,发现经典的 dsRBPs 富集度增强,同时利用 poly (I:C) 进行体外结合实验,与 K1 互作组对比,最终确定了 64 种蛋白作为 “dsRNA 互作组”,这些蛋白具有典型的 dsRBPs 特征。
最后是探究潜在 dsRBPs 对免疫反应和病毒复制的影响。研究人员通过 CRISPR-Cas9 基因敲除筛选发现,大多数潜在 dsRBPs 基因敲除会降低细胞对 poly (I:C) 刺激的干扰素 -β(IFN-β)分泌水平,部分基因敲除则会增强 IFN-β 释放,且 IFN-β 浓度与细胞存活率呈负相关。此外,在研究潜在 dsRBPs 对人冠状病毒 OC43(HCoV-OC43)复制的影响时发现,敲除某些基因会影响病毒复制,且这种影响与对 IFN-β 分泌的影响相关。
综上所述,研究人员通过系统性研究,成功鉴定出 64 种潜在的 dsRBPs,为深入了解细胞 dsRNA 的调控机制提供了宝贵资源。这些发现不仅有助于理解先天免疫过程中对外源 RNA 的感知机制,还为研究病毒感染的防治提供了新的靶点和思路。然而,该研究也存在一定局限性,如无法确定单个 dsRBP 候选蛋白的具体结合 dsRNA 种类,可能存在假阳性结果等。但总体而言,这项研究为 dsRNA 生物学的进一步研究奠定了坚实基础,有望推动相关领域的发展。
研究人员在实验中主要运用了以下关键技术方法:一是免疫沉淀技术,利用 K1 抗体进行免疫共沉淀,捕获与 dsRNA 结合的蛋白;二是质谱分析,对免疫沉淀后的蛋白进行定量质谱分析,鉴定蛋白种类;三是 CRISPR-Cas9 基因编辑技术,构建基因敲除细胞系,研究潜在 dsRBPs 的功能;四是细胞实验,包括细胞培养、转染、感染等,用于检测蛋白表达、IFN-β 分泌水平和病毒复制情况等。
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