Cellular dsRNA 互作组研究揭示外源 RNA 感知调控新机制

为探究细胞双链 RNA（dsRNA）结合蛋白（dsRBPs），研究人员用 K1 抗体捕获 dsRNA 互作组，发现 64 种潜在 dsRBPs，为研究 dsRNA 调控提供资源。

　　在生命的微观世界里，双链 RNA（dsRNA）扮演着十分重要的角色。它不仅是 RNA 病毒复制过程中的常见副产物，作为病原体相关分子模式（PAMP），能触发机体的先天免疫反应；而且人体自身基因组中的重复元件转录出的 RNA，以及线粒体通过双向转录产生的 RNA，也可形成双链结构 。然而，这些内源性 dsRNA 一旦失控，就可能引发严重后果。比如，在骨关节炎患者的滑液、自身免疫性干燥综合征患者的眼泪和唾液，以及亨廷顿病患者的血液中，都能检测到线粒体 dsRNA 水平的升高；短散在核元件（SINE）来源的 dsRNA 的失调和误识别，还与艾卡迪 - 古铁雷斯综合征和年龄相关性黄斑变性的发生有关。

尽管细胞 dsRNA 在病理过程中意义重大且具有潜在治疗价值，但目前对于 dsRNA 结合蛋白（dsRBPs）的了解却十分有限。传统用于系统性识别 RNA 结合蛋白（RBPs）的紫外线（UV）交联和寡聚 dT 磁珠下拉法，在面对 dsRNA 时却无能为力，因为 dsRNA 与 dsRBPs 之间的 UV 交联效率低，且 dsRNA 大多缺乏多聚腺苷酸（poly (A)）尾巴，使得这种方法无法有效捕获 dsRBPs。因此，为了深入探索细胞 dsRNA 的调控机制，韩国科学技术院（KAIST）等机构的研究人员开展了相关研究，其成果发表在《Communications Biology》上。

研究人员采用了一种原创方法，即利用抗 dsRNA 的 K1 抗体进行免疫共沉淀（co-IP），随后进行定量质谱分析，以全面识别与细胞 dsRNA 结合的蛋白。为了降低假阳性，他们还进行了两项额外实验：一是用核糖核酸酶 T1（RNase T1）处理，以降解单链 RNA（ssRNA），确保捕获的 RNA 完全为双链；二是使用合成的 dsRNA—— 聚肌苷酸 - 聚胞苷酸（poly (I:C)）进行体外下拉实验。之后，研究人员通过靶向 CRISPR-Cas9 基因敲除（KO）筛选，评估了这些潜在 dsRBPs 的调控潜力，并在病毒感染实验中进一步探索了 dsRNA 互作组的功能。

在研究结果部分，首先是鉴定人细胞中潜在的 dsRBPs。研究人员利用 K1 抗体能识别长度超过 40bp 的 dsRNA 且无序列特异性的特点，进行免疫沉淀和质谱分析。实验验证阶段，通过 RT-qPCR 检测发现，K1 抗体能显著富集内源性逆转录病毒（ERV）、部分 SINE 和长散在核元件（LINE）等来源的 dsRNA；同时，通过蛋白质免疫印迹分析证实，已知的 dsRBPs 如 ADAR1、PKR 和 STAU1 等，在 K1 共沉淀洗脱液中高度富集。大规模实验中，研究人员鉴定出 1183 种蛋白，从中筛选出 148 种进行深入分析，这些蛋白大多是以往研究未发现的。此外，研究人员还在多种细胞系中进行验证，进一步确认了这些潜在 dsRBPs 与 dsRNA 的结合。

接着是对 K1 捕获蛋白的特征分析。基因本体（GO）分析表明，这些蛋白具有多种 RNA 相关功能，如 “mRNA 3′-UTR 结合”“单链 RNA 结合” 等，其中 “双链 RNA 结合” 是最显著富集的功能。结构域富集分析也显示，RNA 结合结构域和螺旋酶结构域显著富集。

然后是对 K1 互作组 dsRNA 结合能力的验证。研究人员用 RNase T1 处理细胞裂解液，发现经典的 dsRBPs 富集度增强，同时利用 poly (I:C) 进行体外结合实验，与 K1 互作组对比，最终确定了 64 种蛋白作为 “dsRNA 互作组”，这些蛋白具有典型的 dsRBPs 特征。

最后是探究潜在 dsRBPs 对免疫反应和病毒复制的影响。研究人员通过 CRISPR-Cas9 基因敲除筛选发现，大多数潜在 dsRBPs 基因敲除会降低细胞对 poly (I:C) 刺激的干扰素 -β（IFN-β）分泌水平，部分基因敲除则会增强 IFN-β 释放，且 IFN-β 浓度与细胞存活率呈负相关。此外，在研究潜在 dsRBPs 对人冠状病毒 OC43（HCoV-OC43）复制的影响时发现，敲除某些基因会影响病毒复制，且这种影响与对 IFN-β 分泌的影响相关。

综上所述，研究人员通过系统性研究，成功鉴定出 64 种潜在的 dsRBPs，为深入了解细胞 dsRNA 的调控机制提供了宝贵资源。这些发现不仅有助于理解先天免疫过程中对外源 RNA 的感知机制，还为研究病毒感染的防治提供了新的靶点和思路。然而，该研究也存在一定局限性，如无法确定单个 dsRBP 候选蛋白的具体结合 dsRNA 种类，可能存在假阳性结果等。但总体而言，这项研究为 dsRNA 生物学的进一步研究奠定了坚实基础，有望推动相关领域的发展。

研究人员在实验中主要运用了以下关键技术方法：一是免疫沉淀技术，利用 K1 抗体进行免疫共沉淀，捕获与 dsRNA 结合的蛋白；二是质谱分析，对免疫沉淀后的蛋白进行定量质谱分析，鉴定蛋白种类；三是 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，构建基因敲除细胞系，研究潜在 dsRBPs 的功能；四是细胞实验，包括细胞培养、转染、感染等，用于检测蛋白表达、IFN-β 分泌水平和病毒复制情况等。