甘露糖偶联的 rAAV6 与纳米刀片结合可实现高效基因敲入且对造血干细胞和祖细胞无显著毒性

本文聚焦于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）基因编辑，发现甘露糖偶联 rAAV6 与纳米刀片结合可增效减毒。

　　

一、基因编辑治疗血液疾病的研究背景

基因治疗领域中，利用慢病毒载体进行基因添加已成功应用于临床治疗单基因血液疾病，但因其半随机整合存在基因毒性风险 。而基因编辑作为新兴策略，能够精准校正造血干细胞和祖细胞（HSPCs）基因组，且校正后的基因可传递至所有衍生的血液谱系。

CRISPR-Cas9 系统是目前常用的基因编辑平台，通过 Cas9 核酸内切酶和单导向 RNA（sgRNA）引导，可在特定基因组序列引入双链断裂（DSBs） 。DSBs 修复途径包括非同源末端连接（NHEJ）和同源定向重组（HDR） 。NHEJ 常导致靶基因小序列缺失或插入，实现基因敲除；HDR 则需提供模板，可将转基因 cDNA 插入内源性位点，实现基因修复 。对于较大的供体 DNA 模板，需借助如腺相关病毒（AAV）等递送系统。此前研究表明，重组腺相关病毒 6 型（rAAV6）是向 CD34⁺ HSPCs 递送模板 DNA 的良好载体，但高剂量使用时存在细胞毒性问题 。

二、纳米刀片与 rAAV6 结合的基因敲入及毒性问题

研究人员构建了携带 WAS 基因同源重组序列和 GFP 报告盒的 rAAV6 单链 DNA 载体，与纳米刀片（可运输 Cas9/gRNA 核糖核蛋白复合物）结合，用于在人 CD34⁺细胞中进行基因敲入实验 。实验结果显示，随着 rAAV6 剂量增加，GFP⁺ hCD34⁺细胞百分比显著上升，证实了 GFP 表达盒通过 HDR 实现基因组整合 。然而，高剂量 rAAV6（MOI 1E5）与纳米刀片联合使用时，CD34⁺细胞存活率显著降低（仅 10%），即使降低 rAAV6 剂量（MOI 5E4）仍有明显毒性 。这表明 rAAV6 虽能高效引入供体模板实现基因敲入，但高有效剂量会严重影响 CD34⁺细胞存活。

三、rAAV6 和 rAAV2 表面甘露糖生物偶联的构建与表征

为降低 rAAV6 对 CD34⁺细胞的毒性，研究人员尝试在 rAAV6 和 rAAV2 表面偶联甘露糖 。选择赖氨酸和酪氨酸作为偶联位点，利用点击化学分别实现甘露糖与 rAAV6 和 rAAV2 的生物偶联 。通过多种实验方法，如使用特异性抗体检测衣壳蛋白、伴刀豆球蛋白 A 染色检测甘露糖偶联等，证实了甘露糖成功偶联到 rAAV6 和 rAAV2 的衣壳上，且衣壳保持完整 。实验结果表明，rAAV6 和 rAAV2 均可通过赖氨酸或酪氨酸残基与甘露糖高效化学连接。

四、甘露糖偶联 rAAV 对细胞转导和存活的影响

在无纳米刀片的情况下，研究人员评估了不同甘露糖偶联量的 rAAV6 和 rAAV2 对 K562 造血细胞系和原代 CD34⁺细胞的转导效率和毒性 。结果显示，在 K562 细胞中，rAAV2 和 rAAV6 与 3E5 甘露糖（K）当量偶联时，转导效率未降低；但 rAAV6 与 10 倍更多甘露糖（K3E6）或较低水平酪氨酸偶联甘露糖（Y3E5）时，转导效率受阻 。在 CD34⁺细胞中，rAAV2 对照载体与 rAAV6 对照载体转导效率相似，但 rAAV2 不降低细胞存活率 。rAAV6 与低当量甘露糖（K3E5）偶联时，转导效率提高且细胞存活率显著增加 。这表明 rAAV6 与 K3E5 甘露糖当量偶联，可在提高 CD34⁺细胞转导水平的同时，显著降低细胞死亡率。

五、甘露糖偶联 rAAV 在细胞中的基因敲入及细胞存活情况

进一步研究发现，在纳米刀片存在的情况下，甘露糖偶联的 rAAV6 和 rAAV2 在 K562 细胞和预刺激的 CD34⁺细胞中进行基因敲入实验时，rAAV6 与 3E5 甘露糖当量偶联（K3E5）在 CD34⁺细胞中的敲入水平与未偶联的 rAAV6 相当，但细胞存活率从 10% 显著提高到 70% 。增加甘露糖偶联量（K3E6）会降低敲入效率，而进一步研究不同甘露糖偶联量（K8E4、K8E5）对 rAAV6 的影响发现，K8E4 偶联的 rAAV6 敲入水平与未偶联或 K3E5 偶联的相当，且不影响细胞存活；K8E5 偶联则导致敲入水平大幅下降 。此外，纳米刀片与甘露糖偶联的 rAAV6（K3E5）介导的敲入对非常不成熟的 CD34⁺CD38^lowCD90⁺干细胞群体有轻微偏好 。综上，rAAV6 与 3E5 甘露糖当量在衣壳赖氨酸残基上偶联并结合纳米刀片，可在 CD34⁺细胞中实现等效敲入水平，并显著降低细胞死亡率。

六、甘露糖偶联 rAAV6 降低毒性的机制探究

研究人员将经纳米刀片和不同甘露糖偶联水平的 rAAV6 处理的 CD34⁺细胞分化为髓系，以评估毒性副作用 。结果显示，未偶联的 rAAV6 显著减少集落数量，而随着 rAAV6 表面偶联甘露糖量增加，集落数量增多 。通过检测 p53 通路激活水平发现，未修饰的 rAAV6 即使在低剂量下也强烈激活 p53 通路，而甘露糖偶联的 rAAV6 - K3E5 则不会触发该通路 。这表明在 rAAV6 表面展示适量甘露糖可减少 p53 通路介导的毒性，其机制可能是甘露糖阻碍 rAAV6 进入细胞，减少细胞内 rAAV 基因组数量，从而降低 DNA 损伤反应。

七、研究成果总结与展望

本研究表明，rAAV2 可作为 rAAV6 的有效替代载体，在实现高敲入水平的同时避免 CD34⁺细胞死亡 。通过在 rAAV6 衣壳赖氨酸残基上偶联甘露糖，可显著提高 CD34⁺细胞在纳米刀片介导的基因敲入过程中的存活率 。甘露糖偶联的 rAAV6 与纳米刀片结合，为精确治疗性校正 CD34⁺ HSPCs 提供了优秀工具 。未来研究可进一步优化甘露糖偶联密度，探索该技术在更多血液疾病治疗中的应用，为基因治疗领域带来新的突破和希望，推动其向临床应用迈进。